正畸微種植體周圍炎對骨結合界面影響的研究

胡赟 鄭雷蕾 唐甜 趙志河 宋錦璘 鄧鋒

（1.重慶醫科大學附屬口腔醫院 口腔預防與兒童牙病科；

2.正畸科，重慶 400015；3.四川大學華西口腔醫院 正畸科，成都 610041）

正畸微種植體周圍炎對骨結合界面影響的研究

胡赟1鄭雷蕾2唐甜3趙志河3宋錦璘2鄧鋒2

（1.重慶醫科大學附屬口腔醫院 口腔預防與兒童牙病科；

2.正畸科，重慶 400015；3.四川大學華西口腔醫院 正畸科，成都 610041）

目的 研究微種植體周圍炎對微種植體-骨界面的組織學改變，同時對齦溝液相關細胞因子進行檢測，從而探討微種植體周圍炎的發生機制。方法 健康雄性Beagle純種犬4只，采用自身對照，隨機選定實驗動物一側為對照組，一側為實驗組，每側植入4枚微種植體。實驗組種植體頸部結扎絲線，誘導微種植體周圍炎。在植入后第1、2、3、4周分別處死動物，處死前收集種植體周圍齦溝液（PISF），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，收集標本做硬組織切片觀察。結果 根據植入后時間的延長，實驗組微種植體頸部表現明顯的進展性破壞：植入1周微種植體頸部聚集大量炎性細胞，但并沒有破壞皮質骨；植入2周微種植體頸部皮質骨已經出現少量角形吸收；植入3周表現骨吸收進一步向縱深發展；植入4周表現骨吸收已經至第二螺紋，充滿大量膠原纖維。植入后1、2、3、4周，實驗組與對照組PISF和TNF-α相比均有顯著性差異（P<0.05），實驗組高于對照組；實驗組植入后4周PISF和TNF-α顯著高于其余各階段（P<0.05）。結論 微種植體周圍炎首先破壞結合界面頸部，并沿界面進一步縱深發展。無論是健康或者炎癥的微種植體周圍都有TNF-α表現，炎癥的發生可能是造成TNF-α含量上調的始動因素，炎癥的發生進一步加劇了TNF-α表達的上調。

微種植體； 微種植體周圍炎； 腫瘤壞死因子-α； 種植體周圍齦溝液

微種植體應用于正畸臨床在近年來取得了極大的發展。早期對于微種植體的研究主要集中在種植體的骨組織界面，并且取得了突出的成果。近年來，對于微種植體與口腔黏膜上皮的軟組織界面的研究正逐漸引起眾多學者的重視。

種植體與自然牙齒在結構上有著本質的區別，種植體表面沒有牙骨質和牙周膜纖維，與口腔黏膜上皮的附著也不同于自然牙的結合上皮，因而其生物屏障作用就顯得相對薄弱，容易被細菌及其他炎癥因子侵入組織內環境而引起炎癥。微種植體周圍炎（peri-implantitis）是指種植體周圍組織由于受到細菌等致病原的侵襲而引起的組織炎癥反應。微種植體周圍炎往往會導致微種植體-骨界面的喪失、骨組織吸收、微種植體松動，是導致微種植體失敗的主要原因之一。本研究通過建立Beagle犬的微種植體周圍炎的動物模型，研究微種植體周圍炎對微種植體-骨界面的組織學改變，對齦溝液相關細胞因子進行檢測，從而探討微種植體周圍炎的發生機制，以期為微種植體廣泛應用于臨床奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用健康雄性Beagle純種犬4只（由四川大學華西實驗動物中心提供），體重13～14 kg，年齡為18個月。要求牙體、牙列完整，無齲壞及牙周病，咬合關系正常。根據預計觀察的時間，將犬分別編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號，分為1、2、3、4周組。所有Beagle犬均采用籠中特殊飼養的方法，定時、定量攝食，自由飲水。適應性飼養1周后，進行實驗[1]。

1.2 主要實驗材料及試劑

Aarhus microcrew自攻型純鈦微種植釘（直徑1.6mm，螺紋長度6.0mm，穿齦部分長度2.5mm，Medicon公司，德國）；速眠新Ⅱ（長春農牧大學獸醫研究所產）；Eppendorf離心管（Boster公司，中國）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（Immunotech公司，法國），硬組織切片機（Leica公司，德國）；光學顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 植入過程

在Beagle犬后肢臀部肌肉注射麻醉藥速眠新Ⅱ（0.04mL·kg-1）麻醉后，四肢固定于犬固定床，繃帶張口固定，消毒鋪巾。種植手術由同一術者行常規操作完成。含腎上腺素2%利多卡因浸潤注射術區口腔前庭溝底，以減少術區出血和保證麻醉深度。在下頜雙側前磨牙區域用探針暴露頰側骨質，低速引導鉆（鉆速800 r·min-1）鉆開皮質骨，持續用冷生理鹽水沖洗降溫；用就位器將微種植體植入到位。采用同體對照，隨機選定實驗動物一側為對照組，另一側為實驗組，每側植入4枚微種植體。實驗組種植體頸部結扎絲線，誘導微種植體周圍炎產生。

手術后，所有實驗犬均攝入半流質飼料，從而避免硬質食物對微種植體的撞擊，定期對種植體動度和種植體周圍牙齦進行檢查，同時定期對種植區進行X線攝片。

1.4 種植體周圍齦溝液（peri-implant sulcular fluid，PISF）的收集

在植入后第1、2、3、4周分別處死第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號動物，處死前收集PISF。將濾紙剪裁成條狀（2mm×10mm），放置于1.5mL的EP離心管中，用精密電子天平（上海天平儀器廠）定量后備用。收集齦溝液前除盡收集部位的菌斑，隔濕后用氣槍輕輕吹干種植體表面，1min后，將濾紙條插入種植體與軟組織間隙，當有阻力時停止插入，停留30 s后，取出紙簽，放回離心管中，立即稱重。前后重量之差即為PISF的量，以齦溝液的密度為1 g·mL-1計算PISF的體積。然后加入200μL樣本稀釋液置于-70℃冰箱保存待檢。每枚微種植體收集頰、舌、近、遠中向4個位點的齦溝液[2]。

1.5 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測TNF-α

將齦溝液標本在室溫下自然解凍后，低溫離心10min（4℃，10 000 r·min-1），取上清液。將100μL TNF-α標準液、質控液及樣本加入含抗TNF-α單克隆抗體的96板孔中，留出第1孔作空白對照，再加入100μL TNF-α單克隆抗體和堿性磷酸酶于各孔，底物空白孔除外，振蕩培養2 h（18～25℃，350 r·min-1）。洗滌后，加入200μL底物到所有的孔中，振蕩培養30min（24℃，350 r·min-1）。加入50μL終止液，用405 nm的波長檢測吸光度值，計算齦溝液中TNF-α的含量。

1.6 組織學觀察

觀察期畢處死實驗動物，離體取得包含微種植體、黏膜和頜骨的標本，固定于10%甲醛溶液1周。用渦輪機將標本修整成10mm×10mm×6mm組織塊，要求每個組織塊包含1枚種植釘和其周圍至少4mm的骨質和被覆骨黏膜。將組織塊用甲基丙烯酸甲酯包埋，在硬組織切片機上進行切片，然后行甲苯胺藍染色。

1.7 統計學分析

用SPSS 10.0軟件對實驗結果進行統計學分析，實驗數據均以±s表示，樣本均數的比較采用單向方差分析。

2 結果

2.1 臨床觀察

植入微種植體均保持穩定，未見松動脫落，實驗組微種植體周圍黏膜組織腫脹，圍繞種植體頸部，探診有出血。對照組微種植體周圍黏膜顏色正常，未見紅腫，無探針出血（圖1）。

2.2 組織學觀察

根據植入后時間的延長，實驗組微種植體頸部表現明顯的進展性破壞（圖2）：植入1周微種植體頸部聚集大量炎性細胞，但并沒有破壞皮質骨；植入2周微種植體頸部皮質骨已經出現少量角形吸收；植入3周表現骨吸收進一步向縱深發展；植入4周表現骨吸收已經達至第二螺紋，其中充滿大量的膠原纖維（圖2）。

圖1 微種植體植入情況Fig 1 Microscrew implantation

2.3 PISF檢測結果

植入后1、2、3、4周，實驗組與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.05），實驗組PISF量高于對照組；對照組在植入各階段PISF量沒有顯著性差異（P＞0.05）；實驗組各階段PISF量兩兩比較：實驗組植入后4周PISF顯著高于其余各階段（P＜0.05），而植入后2周與3周比較，實驗組PISF量沒有顯著性差異（P＞0.05），見圖3。

2.4 TNF-α檢測結果

植入后1、2、3、4周，實驗組與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.05），實驗組TNF-α量高于對照組；對照組在植入各階段TNF-α量沒有顯著性差異（P＞0.05）；實驗組各階段TNF-α量兩兩比較：實驗組植入后4周顯著高于其余各階段（P＜0.05），而植入后2周與3周比較，實驗組TNF-α量沒有顯著性差異（P＞0.05），見表1。

圖3 微種植體植入后實驗組與對照組各階段PISF量Fig 3 Detection results of PISF between experimental group and control group after microscrew implantation

表1 微種植體植入后實驗組與對照組各階段TNF-α檢測結果Tab 1 Detection results of TNF-α between experimental group and control group after m icroscrew im plantation ng·m L-1

3 討論

3.1 微種植體頸部“生物封閉”

微種植體貫穿口腔黏膜組織，其一端進入組織內環境，另一端在口腔這個外環境是有菌的環境，如果沒有一種封閉屏障存在，微生物則侵入組織內，形成感染。天然牙頸部的生物封閉是由結合上皮、上皮下結締組織、游離齦纖維束、牙槽嵴纖維束的連接作用完成的。因此種植體在貫穿口腔黏膜組織這一區域與軟組織間能否有一種“生物封閉”，對種植體周組織健康和種植體長期穩固性至關重要。

本實驗發現：微種植體周圍炎組在植入后隨著時間的延長，其頸部表現明顯的進展性破壞：植入1周微種植體頸部聚集大量炎性細胞，但并沒有破壞皮質骨；植入2周微種植體頸部皮質骨已經出現少量角形吸收；植入3周表現骨吸收進一步向縱深發展；植入4周表現骨吸收已經至第二螺紋，充滿大量膠原纖維。這說明微種植體對骨界面的破壞可能最先破壞“生物封閉”，隨后進一步縱深發展，引起微種植體的松動甚至脫落。有學者觀察到種植體頸部存在類同天然牙頸部的基板和半橋粒結構，培養的上皮細胞可在鈦、羥磷灰石等材料表面形成基板和半橋粒形式的黏附。這種類同天然牙頸部的“生物封閉”機制的存在，對種植體的成功性予以理論支持[3-4]。種植手術后，血液及組織滲出液與種植體接觸，很快吞噬成纖維細胞與種植體表面接觸，并分泌細胞外基質附著在種植體表面，術后1周就有上皮附著發生，在術后3周就可形成“生物封閉”。一些因素可破壞建立起的“生物封閉”，病理過程與牙周病機制相同。

3.2 PISF與微種植體周圍炎的關系

齦溝液是一種炎性滲出液，它的產生與齦下菌斑的性質和比例密切相關。牙齦炎癥時齦溝內含有的菌斑微生物產生一定量的大分子產物，這些產物在細胞與基底膜間擴散，聚集于基底膜，從而產生了持續的滲透梯度，形成了齦溝液的流動。與自然牙一樣，種植體周圍也存在齦溝。PISF是指種植體周圍滲出的液體。本研究發現：實驗組在植入各階段PISF量高于對照組，這表示微種植體周圍PISF量的增加是由于種植體周圍炎癥的發生而發生，這一結果與牙周病學的研究相似[5]。研究還發現：實驗組植入后4周PISF和TNF-α顯著高于其余各階段，同時組織學研究也顯示骨界面的破壞在實驗組呈進行性發展，在4周時破壞最明顯。這提示PISF量更多的是反映了種植體周圍骨組織的變化，與Last等[6]和徐淑蘭等[7]的研究結果一致。

3.3 細胞因子TNF-α參與微種植體周圍炎的機制

本實驗結果表明：微種植體周圍組織無論是健康還是有炎癥，其PISF中均有TNF-α的表達，微種植體周圍炎的TNF-α的表達高于無炎癥者。PISF來源于血漿和組織液的滲出，推測微種植體周圍組織健康者的TNF-α可能是血漿中滲出所致[8-9]。微種植體周圍炎組TNF-α表達水平高于健康組，說明炎癥的發生可能是造成TNF-α含量上調的始動因素，炎癥的發生進一步加劇了TNF-α表達的上調。文獻[10-11]報道：細胞因子可以通過旁分泌、自分泌調節免疫細胞，促進破骨細胞的活性，參與炎癥過程，導致組織破壞。徐淑蘭等[7]研究犬實驗性種植體周圍炎齦溝液滲出的幾種炎性細胞因子濃度的變化與骨吸收的關系發現：絲線結扎4周時齦溝液細胞因子的濃度明顯增高，骨性界面的骨組織出現明顯吸收。這與本研究結果一致，結合實驗進行的含微種植體的硬組織切片觀察，說明實驗性微種植體炎進展到4周時，骨吸收最明顯。

微種植體周圍炎是正畸微種植體脫落的重要原因，涉及到口腔微生物學、種植學、正畸學、生物力學等多種交叉領域，如何進一步明確微種植體周圍炎的發生機制和優化微種植體植入設計方案尚需進一步探討。

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（本文編輯 湯亞玲）

Influence of the peri-im p lantitis to the m icroscrew-bone interface

HU Yun1,ZHENG Lei-lei2,TANG Tian3,ZHAO Zhi-he3,SONG Jin-lin2,DENG Feng2.（1.Dept.of Preventive and Pediatric Dentistry，The Affiliated Stomatology Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400015,China；2.Dept.of Orthodontics,The Affiliated Stomatology Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing400015,China；3.Dept.of Orthodontics,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo study the histological change of microscrew-bone interface,detect the relative cytokine of gingival crevicular fluid,and explore the impossible mechanism of peri-implantitis.MethodsFour male Beagles were collected.Random ly select one side of animals jaw as the experimental group to induce the peri-implantitis, and another side as the controll group.Four microscrews were implanted on each side.In the 1st,2nd,3rd,4th weeks after implantation,collect peri-implant sulcular fluid（PISF）and detect tumor necrosis factor-α（TNF-α）levels before sacrificed,and the harvest tissue were observed in histological ways.Results According to the extension of time after implantation,the experimental group showed visible progress of interface destruction:1st week after implantation showed large numbers inflammatory cells collected at the neck but did not undermine the cortical bone;2nd week after implantation,cortical bone were observed angular absorption;Bone resorption continued to develop and at the 4th week,bone resorption were enlarged to the second thread of microscrew and the interface was filled with a large number of collagen fibers.ConclusionThe destruction of interface began at the neck of microscrew,and the further development was along the interface in depth. Both microscrews with peri-implantitis and the healthy controls showed the presence of TNF-α.Inflammation accumulation might trigger the up-regulation of TNF-α level,and the onset of inflammation would enhance the up-trend.

microscrew； peri-implantitis； tumor necrosis factor-α； peri-implant sulcular fluid

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.005

1000－1182（2011）01－0017-04

2009-12-30；

2010-03-10

國家自然科學基金資助項目（81000463和10902075）；高等學校博士學科點專項科研基金新教師類基金資助項目（200955031-20006）

胡赟（1979—），男，四川人，主治醫師，博士

鄭雷蕾，Tel：15086986968