膠質細胞源性神經營養因子在自體靜脈橋修復面神經缺損中促進神經再生的效應

唐杰 戚孟春 胡靜

（1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 口腔頜面外科，上海 200011；2.河北聯合大學 口腔系，唐山 063000；3.四川大學華西口腔醫學院 口腔頜面外科學教研室，成都 610041）

膠質細胞源性神經營養因子在
自體靜脈橋修復面神經缺損中促進神經再生的效應

唐杰1戚孟春2胡靜3

（1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 口腔頜面外科，上海 200011；2.河北聯合大學 口腔系，唐山 063000；3.四川大學華西口腔醫學院 口腔頜面外科學教研室，成都 610041）

目的 旨在研究膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）在自體靜脈橋修復面神經缺損中促進神經再生的效應。方法 選用36只成年雄性新西蘭大白兔作為實驗動物，切除雙側10mm長面神經頰支，制作面神經缺損動物模型。以同側面后靜脈作為神經再生管道，修復面神經缺損。靜脈管腔內分別注入生理鹽水（A組，n=16）或GDNF溶液（B組，n=16）。分別于手術后當時，及術后4、8、16周誘發面神經動作電位，評價神經功能。于術后4、8、16周每組分別隨機處死6只動物，切取術區神經標本，行組織學與透射電鏡觀察。結果 手術后當時，2組實驗動物均無動作電位產生；而術后4、8、16周，2組均有動作電位出現。除術后4周時動作電位波寬2組無顯著差異外，B組動作電位的波幅在術后4周和8周均顯著高于A組（P<0.01），而潛伏期顯著短于A組（P<0.01），波寬在術后8周顯著高于A組（P<0.01）。術后16周，除動作電位波幅B組顯著高于A組外（P<0.01），波寬和潛伏期2組均無顯著差異。形態學及透射電鏡觀察顯示，B組再生神經有更多的成熟的有髓神經纖維，更早出現有活力的Schwann細胞。結論GDNF在自體靜脈橋修復面神經缺損中可有效促進神經再生；GDNF復合自體靜脈橋為臨床面神經缺損修復提供了一個極具價值的途徑。

面神經缺損； 自體靜脈移植； 膠質細胞源性神經營養因子； 動作電位

外傷、腫瘤切除或醫源性因素很容易造成面神經損傷與缺損；自體靜脈作為橋接的管道用來修復神經缺損在臨床及動物實驗中已有較多報道[1-4]。盡管自體靜脈作為神經再生的管道有其獨特的優越性，但仍然不能早期很好地恢復神經的功能。有研究[5-7]表明：膠質細胞源性神經營養因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）對神經損傷修復具有重要作用，能夠促進外周神經再生，逆轉軸突切除引起的運動神經元的死亡，并能顯著促進神經外胚層細胞的存活。其能否應用于面神經缺損的修復，目前國內外還缺乏研究報道。本研究旨在探索GDNF在自體靜脈橋修復面神經缺損中促進神經再生的作用，以尋求早期恢復面神經功能的有效方法，為臨床上面神經缺損修復提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物模型及分組

選用36只健康成年雄性新西蘭大白兔作為實驗動物（四川大學華西實驗動物中心提供），體重2.0～2.5 kg。經口外在雙側下頜骨下緣上方1.5 cm、眶下2 cm，從下頜骨后緣至鼻翼做平行于下頜骨下緣的切口，暴露面后靜脈、嚼肌及腮腺組織。截取長約13～14mm的面后靜脈，生理鹽水沖洗管腔，室溫下置于生理鹽水中待用。自腮腺前緣向前分離面神經頰支，節段性切除10mm，保留分布于上唇方肌的主支，制作面神經局部缺損動物模型。同時，以同側面后靜脈作為修復神經缺損的管道，將靜脈袖套式縫合于神經2個殘端的神經外膜上，面神經殘端插入靜脈腔內約2mm[1]。實驗動物隨機分為A、B組（各18只）：A組靜脈管腔內注入0.4mL生理鹽水；B組則注入0.4mL GDNF溶液（5 ng·mL-1）。縫合手術創口，常規動物飼養；術后實驗動物肌注青霉素每天每只80萬單位，連續肌注3 d，預防創口感染。

1.2 檢測指標與方法

1.2.1 神經功能恢復評價 面神經功能恢復評價采用神經干動作電位法。測試設備包括刺激電極和計算機程控刺激器（中國BL－NewCentury生物機能實驗軟件）。測試前應用測試設備測定誘發正常面神經神經干動作電位的最適刺激強度。

將刺激電極與計算機程控刺激器的輸出端相連，并將刺激電極置于修復再生的神經近心端，給予1.00 V的單脈沖電刺激（正常面神經的最適刺激強度）；將記錄電極置于修復再生神經的中份，記錄電極引導的生物電輸入計算機電位通道接口，經程控生物放大器放大，A/D轉換，計算機處理顯示動作電位。

分別于手術后當時、術后第4、8、16周，從2組動物中隨機選擇6只動物，全麻下解剖出術區面神經，測定再生神經的動作電位。觀察指標有神經干動作電位的幅度、波寬和潛伏期。

1.2.2 形態學及超微結構檢測 于手術后第4、8、16周，在測定神經干動作電位后，麻醉下處死實驗動物（每組每一時間點6只動物），解剖分離再生的面神經，在距神經斷端近中、遠中各約4mm截取標本，標記近遠中方向。左側面神經標本用10%中性甲醛固定24～48 h，常規乙醇脫水、石蠟包埋；并制備5μm厚切片，Harris蘇木精-伊紅染色。

右側面神經標本在再生神經正中，截取長2mm的標本，3%的戊二醛（pH7.3～7.4）4℃固定24 h，磷酸鹽緩沖液沖洗。然后用1%四氧化餓（pH7.3～7.4）4℃二次固定2 h，磷酸鹽緩沖液再次沖洗20min，梯度丙酮逐級脫水，Epon 812環氧樹脂橫向包埋。制備半薄切片（1μm），美蘭染色，在光鏡下任意選擇15個40μm×40μm的視野，對再生的有髓神經纖維用OPTMAS 6.0-2計算機軟件進行計數。再制備超薄切片，布于覆蓋有Formvar膜的圓形銅載網上，醋酸鈾和枸緣酸鉛雙重染色后透射電鏡觀察，了解神經微觀結構及Schwann細胞再生情況。

1.2.3 統計學分析 計量資料用均數±標準差表示。應用SPSS 10.0軟件對2組實驗動物再生神經動作電位的參數和再生有髓神經纖維數目進行獨立樣本的t檢驗，比較2組的差異。P≤0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 面神經缺損動物模型

所有實驗動物均很好地耐受了手術，術后創口無感染，并能自由取食。本研究成功建立了自體靜脈修復兔面神經缺損的動物模型。

2.2 神經功能恢復評價

正常面神經最適刺激強度（1.00±0.11）V，神經動作電位波幅為（12.25±0.33）mV，波寬為9.06ms,潛伏期為（1.26±0.03）ms。2組實驗動物在手術后當時（0周），給予電刺激后均無動作電位產生；而術后第4、8、16周，均出現動作電位，但動作電位參數二者有明顯差異（圖1，表1）。

圖1 術后4周A組（A）和B組（B）再生神經動作電位Fig 1 Action potential of group A（A）and group B（B）4 weeks after operation

手術后4周，2組再生神經動作電位的波幅和潛伏期比較均有統計學差異（P＜0.01），A組波幅顯著小于B組，而潛伏期長于B組。波寬2組無顯著差異（P＞0.05）。手術后8周，2組神經動作電位的波幅、波寬和潛伏期比較均有統計學差異（P＜0.01），A組波幅、波寬顯著小于B組，而潛伏期長于B組。手術后16周，2組神經動作電位除波幅A組顯著小于B組外（P＜0.01），波寬和潛伏期二組比較無統計學差異。手術后隨著時間的延長，2組神經動作電位的波寬和波幅逐漸增加，而潛伏期逐漸縮短，說明神經功能趨于正常；但是直到術后16周，2組面神經動作電位3項參數與正常值比較均有統計學差異（P＜0.01）。

表1 不同時間點再生面神經動作電位比較Tab 1 Analysis of action potential of regenerated facial nerve in differentiation time points

2.3 形態學及超微結構觀察

術后4、8周2組再生神經纖維經常形態見圖2。

圖2 術后4、8周2組再生神經纖維Fig 2 Regenerated myeliated nerve fibers of two groups after 4 and 8 weeks of operation

手術后4周，2組靜脈橋管內可見再生神經纖維形成，成束排列，主要為無髓神經纖維，有髓神經纖維較少，且髓鞘壁較薄；神經束間可見新生血管，并可見大量的膠原纖維，鞘壁Schwann細胞增生活躍，核大，異染色質分布不均勻（圖2A，2D）。再生神經只占據靜脈管腔的一部分，且神經纖維數目A組明顯少于B組。手術后8周，2組再生神經纖維數目均明顯增加（表2）。2組比較，A組神經纖維較稀疏，有髓神經數目較少，膠原纖維較多；而B組再生神經纖維密集成束，有髓神經纖維較多，膠原纖維較少；有髓神經纖維髓鞘壁較厚（圖2B，2C）。術后16周，2組新生神經纖維數目繼續增加，有髓神經纖維數目在新生軸索中占絕對多數，髓鞘壁進一步增厚，少見活躍的Schwann細胞；但B組神經纖維數目仍明顯多于A組。

表2 2組再生有髓神經纖維數比較Tab 2 Com paration of new ly regenerated m yeliated nerve fibers between two groups ±s

表2 2組再生有髓神經纖維數比較Tab 2 Com paration of new ly regenerated m yeliated nerve fibers between two groups ±s

注：△2組比較，P<0.01。

組別 術后4周△ 術后8周△ 術后16周A 728±36 1 974±86 4 340±179 B 1 623±141 3 012±77 4 697±291

3 討論

外傷、腫瘤切除或醫源性因素等很容易造成面神經缺損。面神經缺損的再生修復受到許多因素的影響。Longo等[8]認為神經再生的成功與否有賴于是否存在適宜神經再生的生理微環境。該適宜的生理微環境包括具有活力的Schwann細胞、各種神經生長因子（nerve growth factors，NGF）、營養因子（nutrient promoting factor，NPF）的參與、局部良好的血液供應和供神經生長的空間神經導管系統?？梢宰鳛樯窠浽偕鷮Ч芟到y的材料有很多，多采用自體導管系統和合成生物材料。后者有硅膠管、膠原管、聚四氟乙烯管等[9-11]。自體導管系統多為自體動、靜脈[1-4]。

自體靜脈作為神經再生導管有其獨特的優越性：不會引起免疫反應和供區功能障礙、容易獲取、不需要開辟第二個手術區；管壁薄，有一定的通透性，既能阻擋周圍結締組織的長入，又有利于營養物質穿透靜脈壁。Levine等[12]的研究還發現靜脈壁上有神經生長因子的表達，在神經生長過程中可能會起到促進神經生長的作用。臨床及實驗研究[1-4]均證明：自體靜脈可用以修復外周神經缺損，使神經功能達到一定程度的恢復。但是，自體靜脈修復神經缺損是緩慢的過程，而早期神經功能的恢復不僅可盡快行使相應的功能，而且可以避免因為神經功能缺失而引起的肌肉萎縮。因此，尋求早期促進神經功能恢復的方法仍然是神經再生修復領域研究的重點。

GDNF對神經再生有重要促進作用。Mograbi等[7]研究表明：GDNF可通過提高Akt活性對抗ERK途徑引起的神經外胚層細胞凋亡。GDNF基因轉染的Schwann細胞可提高運動神經元存活，并有效促進外周神經再生[5]。GDNF還可通過作用于Schwann細胞內的信號通路，促進其遷移，并在有髓神經形成早期發揮作用[13]。

本研究在采用自體面靜脈橋修復面神經缺損的基礎上，應用GDNF來促進神經的再生修復。實驗結果表明，在手術后4周，應用GDNF組面神經動作電位的波幅顯著高于對照組，而潛伏期顯著小于對照組；說明實驗組面神經功能優于對照組，GDNF發揮了促進面神經再生的作用。而GDNF的作用在手術后8周更為明顯，實驗組神經動作電位的波幅、波寬均顯著高于對照；而潛伏期則顯著小于對照。到手術后16周，GDNF的作用明顯減弱，除實驗組波幅顯著高于對照組外，波寬及潛伏期2組均無顯著差異。上述結果說明，GDNF具有在早期（4、8周）明顯促進面神經再生的作用，其作用在術后8周達到最高；而隨著時間的延長，GDNF的作用逐漸消退。形態學及超微結構觀察也表明，GDNF處理組有髓神經數目、Schwann細胞活躍程度及新生血管情況均明顯優于對照組。進一步證實了GDNF促進神經再生的效應。

需要指出的是，在本研究中雖然GDNF可在自體靜脈橋修復面神經缺損中有效促進神經再生，一定程度上在早期恢復了面神經功能；但GDNF促進面神經再生的作用仍有限，直到術后16周，GDNF組再生神經功能尚未恢復正常，這可能與以下2個因素有關：首先，GDNF為膠質細胞源性的神經生長因子，需要作用于神經節細胞才可以起到促進神經生長的作用[6]，本研究是把GDNF注入靜脈的橋管內，GDNF可能需要沿近心端神經軸索上溯至神經節細胞才能對其產生修復作用。因此表現為在最早期促進神經修復的作用較弱。其次，本實驗為一次性給藥，經過長時間機體的作用，GDNF會被消耗或崩解，這可能是后期GDNF作用有限的原因。如果采用在距離神經節細胞較近的部位比如莖乳孔給藥，或者采用持續或多次給藥的方法可能會收到更好的效果。

本研究在采用自體面靜脈橋修復面神經缺損的基礎上，應用GDNF有效促進了面神經缺損的再生，在一定程度上促進了神經功能的早期修復。該方法對臨床面神經缺損的修復具有重要的借鑒意義。

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（本文編輯 湯亞玲）

Effect of glial cell derived neurotrophic factor on regeneration of facial nerve defects by autogenous vein conduit

TANG Jie1,QI Meng-chun2,HU Jing3.（1.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,The Ninth People’s Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai200011,China;2.Dept.of Stomatology, Hebei United University,Tangshan063000,China;3.Dept.of Oral and Maxillofacial Surgery,West China College of Stomatology,Sichuan University,Chengdu610041,China）

ObjectiveTo study the effects of glial cell derived neurotrophic factor（GDNF）on regeneration of facial nerve defects by autogenous facial vein conduit.MethodsThirty-six rabbits were used in this study and 10 mm-length facial nerve defects were made on both sides of all animals.The nerve gaps were bridged using autoge-nous posterior facial vein graft of the same side.The animals

injection of either saline（group A,n= 16）or GDNF（group B,n=16）into the veins.Nerve function was evaluated by evoking nerve action potential immediately after operation and 4,8 and 16 weeks after operation.Regenerated nerve samples were harvested at 4,8, and 16 weeks after operation and processed for histology and transmitting electron microscopic examination（TEM）. Results Action potential did not exist immediately after operation but it was evoked at 4,8,and 16 weeks in both groups.At 4 and 8 weeks after operation,the amplitude and width of action potential were significantly higher in group B than group A（P<0.01）,except wave width at 4 weeks,which showed no significant differences,while the latency period was significantly shorter in group B than that in group A（P<0.01）.At 16 weeks,action potential was similar between two groups,except wave amptitude,which was higher in group B than group A（P<0.01）.Morphologic and TEMexaminations showed more matured myelinated nerve fibers and active Schwann’s cells in group B when compared group A during the whole regeneration process.ConclusionGDNF can promote nerve regeneration at early stage during reconstruction of facial nerve defects by autogenous faical vein conduit and combination of GDNF and autogenous vein graft provides a valuable method for clinical reconstruction of facial nerve defects.

facial nerve defect； autogenous vein graft； glial cell derived neurotrophic factor； action potential

R 622

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.01.021

1000－1182（2011）01－0087-05

2010-04-10；

2010-06-24

四川省科技攻關基金資助項目（05SG022-019-3）

唐杰（1973—），女，河南人，副主任醫師，博士

胡靜，Tel：028-85502339