大腸桿菌工程菌K12△dapA發酵產L-蘇氨酸培養基的優化

楊曉志，李偉星，張君勝，張 力

（江蘇畜牧獸醫職業技術學院，江蘇 泰州 225300）

蘇氨酸為一種重要的氨基酸，在飼養業、食品以及醫藥行業等方面都有著極其重要的用途[1]。2005年蘇氨酸全球產量達到7萬t，繼谷氨酸、賴氨酸后成為年產量第三的氨基酸。我國的氨基酸發酵工業相對落后，工業化發酵生產蘇氨酸的水平提高緩慢，每年都需進口蘇氨酸類產品以滿足市場需求，短期內國內市場供需矛盾無法根本解決[2-5]。因此，開展L-蘇氨酸生產菌的選育與發酵條件的研究，對提高蘇氨酸的產率、縮短我國氨基酸發酵工業與國際水平的差距都具有一定的意義。

微生物發酵法生產蘇氨酸是目前主要的工業生產方法，由于大腸桿菌（Escherichia coli）繁殖迅速、發酵溫度高、生理生化基礎研究比較深入等特征成為L-蘇氨酸生產的最常用菌株[6]。本研究對利用Red同源重組技術無痕敲除dapA基因獲得的大腸桿菌工程菌K12△dapA進行搖瓶分批發酵優化試驗，篩選最佳種子培養基及培養條件和最佳發酵培養基及發酵培養條件，旨在為工程菌的發酵條件控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 大腸桿菌工程菌K12△dapA，由本研究室構建，該菌缺失二氫吡啶二羧酸合成酶（dapA）的編碼基因，為產L-蘇氨酸的賴氨酸缺陷型菌株。

1.1.2 試 劑 生物素、硫胺素、L-蛋氨酸為上海生工產品。其他試劑均為國藥分析純試劑。

1.1.3 培養基 基礎種子培養基（g/L）：葡萄糖30、玉米漿20、硫酸銨5、磷酸二氫鉀1、七水硫酸鎂0.5、碳酸鈣 15、pH 7.0，115℃ 滅菌 15min，4℃保存。基礎發酵培養基（g/L）：葡萄糖120、玉米漿15、硫酸銨30、磷酸二氫鉀1、七水硫酸鎂0.5、碳酸鈣 15，生物素 100 μg/L、硫胺素 300 μg/L，pH 7.0，115℃ 滅菌15min，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 分析方法 （1）種子生長曲線的測定：取一環新鮮活化的菌種，接于裝有30mL種子培養基的250mL錐形瓶中，振蕩培養，每隔一定時間取樣200μL用5mL 0.25 M HCl溶液稀釋26倍后測定菌液吸光度（OD562）[7]。以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制菌體生長曲線。（2）L-蘇氨酸測定：用薄層層析法定性和茚三酮比色法定量測定，具體試驗方法參照文獻[8]。

1.2.2 種子培養方法 取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，37℃恒溫靜置培養過夜。接一環生長良好的活化斜面至裝有30 mL種子培養基的250 mL搖瓶中，8層紗布封口，置于旋轉式搖床上200 r/min，37℃振蕩培養至對數生長中后期。

1.2.3 搖瓶發酵培養方法 取種子培養液以10%接種量接入裝有15mL發酵培養基的250mL錐形瓶中，8層紗布封口，置于旋轉式搖床上200 r/min，37℃振蕩培養72 h。每個試驗組至少重復2次。

1.2.4 種子培養基主要成分的優化 對種子培養基中幾種主要成分：葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、酵母膏各取3個水平，對它們進行4因素3水平的正交試驗。正交實驗因素與水平的選取如表1所示。每個試驗組重復2次。

表1 正交試驗因素與水平 （g/L）

1.2.5 發酵培養基的優化[9-12]采用6因素10水平10組試驗的方式[U*10（106）均勻表]，考察了葡萄糖（X1）、硫酸銨（X2）、玉米漿（X3）、KH2PO4（X4）、生物素（X5）、蛋氨酸（X6）對產酸的影響。各因素的水平數、試驗安排見表2。

2 結果與分析

2.1 種子培養基的優化及其培養條件的優化

2.1.1 種子培養基碳氮源的選擇 為了尋找最適宜菌種生長且利于后期產酸的種子培養基成分，比較了幾種碳氮源對于菌種生長及產酸的影響。所選的碳源有葡萄糖、檸檬酸鈉、蔗糖和麥芽糖，氮源有硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和乙酸銨。碳源添加量以與所添加的葡萄糖達到相同的含碳質量為準，氮源添注：葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、KH2PO4添加量單位為g/L、蛋氨酸、生物素添加量為μg/L。加量以與所添加的硫酸銨達到相同的含氮質量為準。將菌種接入不同成分的種子培養基上，培養至對數生長中后期，接入發酵培養基，發酵72 h，以產酸為指標，其結果如圖1、2所示。

表2 發酵培養基均勻設計試驗方案

圖1 種子培養基不同碳源的比較

圖2 種子培養基不同氮源的比較

從圖1可以看出，葡萄糖是幾種碳源中最利于產酸的。同時還可以看出以單糖作為種子培養基碳源明顯比用二糖產酸要好。由圖2可知，硫酸銨是最佳的種子培養基氮源。葡萄糖和硫酸銨分別是種子培養基最佳碳氮源，這可能是因為以此為培養基的種子能夠更快地適應發酵培養基的環境。

2.1.2 種子培養基主要成分的優化 確定了種子培養基的碳氮源之后，對種子培養基中主要成分葡萄糖、硫酸銨、玉米漿、酵母膏各取3個水平，進行4因素3水平的正交試驗。結果如表3所示，種子培養基各組份含量的不同對產酸是有影響的。如果培養基中營養物質過于豐富，會引起菌體生長過快，以致發酵產酸后勁不足；但如果營養物質缺乏，導致種子生長緩慢，代謝活力低，也不利于高產酸。

由表3可知，各因素對產物的影響順序依次為玉米漿、酵母膏、葡萄糖和硫酸銨。玉米漿對種子質量影響最大，酵母膏其次，這是因為玉米漿和酵母膏中含有豐富的生物素、游離氨基酸和多種生長因子，是較理想的營養物質，微生物在這種富含有機氮源的培養基中，可以直接利用游離氨基酸或其它有機化合物的碳架，合成用于構成細胞的蛋白質和其他細胞物質，有利菌體生長。因此，確定各因素的最優水平為A1、B3、C3、D2。根據正交試驗結果和實際考慮確定最佳種子培養基配比（g/L）：葡萄糖30，（NH4）2SO46，玉米漿 40，酵母膏 0.8，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，碳酸鈣 15。

表3 L9（34）正交表試驗表及正交結果

由表4可看出，當置信度為0.05時，玉米漿和酵母膏對種子培養基的影響極顯著。由于正交試驗所確定最佳條件并未包含在正交表的9個試驗中，為了進一步確定計算結果，采用最佳條件進行了驗證，結果見表5。

表4 正交試驗方差分析

表5 驗證試驗結果

由表5可知，驗證試驗的產酸量處于正交試驗的較高水平，試驗結果較為理想。

2.1.3 種子培養時間確定 將大腸桿菌工程菌K12△dapA從新鮮斜面活化培養基上取一環接種到最佳種子培養基中培養，每隔一定時間取出少量種子液，用0.25 M HCl稀釋20倍后測定種子液的OD562值，繪制種子生長曲線，結果如圖3。

圖3 大腸桿菌工程菌K12△dapA生長曲線

從生長曲線中可以看出，菌體從3 h開始進入對數期，10 h以后進入穩定期。一般選對數生長期后期到穩定期前期這段時間內的菌種作為種子，因為此時菌體數量多、生長旺盛。根據圖3所示結果，取8 h作為最佳種子培養時間。

2.2 發酵培養基的優化

根據表2發酵培養基均勻試驗設計，水平1至10 的實測值 分 別 為 ：5.25、3.57、3.47、4.07、3.04、7.42、7.56、6.78、5.52、4.09 g/L。經過回歸分析獲得R2=0.997 219，回歸方程如下：

表6 回歸結果

由表6各變量影響顯著性檢驗值t可排出各因素對產酸的影響大小順序：X4>X3>X5>X2，根據MDAS數據分析系統的分析可直接找出極值，結合實際取 X2=55，X3=30，X4=0.2，X5240，X6=200，代入回歸方程，預測產L-蘇氨酸為8.48 g/L。

優化結果：以上述優化種子分別接入原發酵培養基（1號）和優化發酵培養基（2號）進行發酵條件的優化發酵試驗，結果如表7所示。結果表明，由回歸方程所得出的最高產酸量的預測值與驗證試驗的平均值較接近，說明回歸方程能夠比較真實地反映各因素對L-蘇氨酸發酵產酸的影響，對于發酵條件的研究具有較好的指導意義。

表7 發酵比較結果

根據上述結果，確定了最佳發酵培養基配比（g/L）：葡萄糖 120，硫酸銨 55，玉米漿 30，KH2PO40.2，七水硫酸鎂0.5，生物素240μg/L，硫胺素300 μg/L，蛋氨酸200 μg/L ，CaCO330(分消)。

3 討論

L-蘇氨酸是初級代謝產物，產物的形成與菌體的生長相關，一方面，生長良好的菌體其生長速率較高，即葡萄糖將有效地導向L-蘇氨酸的合成；另一方面，如果菌體生長過于旺盛，過多的用于合成細胞碳架結構，相應的合成L-蘇氨酸的代謝流就會減少。所以發酵培養基的優化是合理利用微生物發酵能力的保證。而良好的種子培養基配方是保證發酵種子生長旺盛、發酵產酸穩定高產的先決條件，因此，優化種子培養基很有必要。

本研究通過對大腸桿菌工程菌K12△dapA進行種子培養基、發酵培養基的優化，得到的最佳種子培養基為（g/L）：葡萄糖 30，（NH4）2SO46，玉米漿40，酵母膏 0.8，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，碳酸鈣15，pH 7.0，37℃，搖瓶轉速為 200 r/min，裝液量為30mL/250 mL搖瓶，最佳種齡為8 h。在此條件下產酸由3.7 g/L提高至3.8~3.9 g/L。應用均勻設計試驗法，確定了最適發酵培養基的組成及配比(g/L)：葡萄糖 120，硫酸銨 55，玉米漿 30，KH2PO40.2，七水硫酸鎂 0.5，生物素 240μg/L，硫胺素 300μg/L，蛋氨酸 200μg/L，CaCO330（分消）。發酵72 h產酸由3.8~3.9 g/L提高至8.2~8.3 g/L，通過培養基優化產酸（3.7 g/L）提高了近1.2倍。

[1] Debabov,Vladimir G.The threonine story[J].Advancesin Biochemical Engineer-Biotechnology，2003,79:113-136.

[2] 賈冬舒.蘇氨酸市場現狀及發展前景[J].飼料廣角,2006，（1）：28-29.

[3] 王宏齡，富春江，韓小丹，等.全球主要氨基酸生產企業新動向[J].精細與專用化學品，2005，24：29-38.

[4]Cho JY,Kim D C,Lee B C,et al.Method for producing L-threonine:U.S.A,7074602[P],2006：7-11.

[5] 許益清，張偉國.L-組氨酸產生菌株的選育[J].食品與發酵工業，2005，31（1）：83-85.

[6] 杜連祥，路福平.微生物學實驗技術[M].北京:中國輕工業出版社，2005.174-184.

[7] 方開泰.均勻設計與均勻設計表[M].北京:科學出版社，1994.

[8]夏 永.均勻設計在微生物制藥工藝研究中的應用-利用計算機進行試驗的設計與分析 [A].第七次全國抗生素學術會議，1993.