iASPP真核表達載體的構建及其對NIH3T3細胞增殖的影響

孔凡銘，張新偉，于津浦，魏 楓，李 慧，任秀寶

（天津醫科大學腫瘤醫院免疫室，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060）

p53凋亡刺激蛋白家族的抑制成員(inhibitory member of the ASPP family,iASPP)是最近發現的能特異性抑制p53抑癌功能的蛋白[1]，并在多種腫瘤細胞中存在過表達現象，且能抑制p53的促凋亡活性[1-6]，提示抑制iASPP的高表達可能成為恢復p53抑癌功能的新策略。本研究成功構建FLAG-pcDNA3.0-iASPP質粒，并初步驗證該質粒能夠正確編碼FLAG-iASPP蛋白，促進NIH 3T3細胞增殖。

1 材料和方法

1.1 質粒及試劑 FLAG-pcDNA3.0載體系中國協和醫科大學血研所王建祥教授惠贈；PCMV-iASPP克隆購自OriGene公司；大腸桿菌DH5α和NIH3T3細胞系由本室保存；引物合成、脂質體轉染劑均為Invitrogen公司提供；限制性內切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；小鼠iASPP單克隆抗體購自Sigma公司，山羊抗小鼠（HRP標記）抗體購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司；細胞培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自HyClone公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；質粒抽提試劑盒購自TIANGEN公司；PCR試劑購自TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 FLAG-pcDNA3.0-iASPP質粒的構建及鑒定

根據GenBank iASPP基因序列信息，設計并合成引物。引物正義鏈：5′-AGCTGAATTCCGCCACCATGGACAGCGAGGCATTC-3′，5′端加入EcoR I酶切位點；反義鏈：5′-TAGTCTCGAGCTAGACTTTACTCCTTTGAGGCTTCACC C-3′，5′端加入Xho I酶切位點，擴增產物約2713bp。以源克隆PCMV-iASPP為模板PCR擴增iASPP的CDS區，Eco R I與Xho I限制性內切酶消化真核表達載體FLAG-pcDNA3.0及切膠回收的PCR產物。再次純化后，T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉化感受態大腸桿菌DH5α，37℃培養12h。挑取單個克隆進行過夜培養，提取質粒進行酶切和測序鑒定。其中測序工作委托上海Invitrogen公司完成。

1.2.2 基因轉染及穩定表達細胞株的篩選 NIH3T3細胞培養至對數生長期時，收獲細胞。以5×104/孔接種于6孔板中，孵育24h后進行轉染，按Lipofectin Reagent試劑盒操作說明，將FLAG-pcDNA3.0-i ASPP和空載體FLAG-pcDNA3.0各4μg，分別轉染NIH3T3細胞，轉染6h后更換完全培養基，48h后1∶10傳代并以500μg/mL G418篩選21～30d，所得陽性克隆繼續培養，未轉染的NIH3T3細胞作空白對照。

1.2.3 FLAG-pcDNA3.0-iASPP在NIH3T3細胞中的表達

1.2.3.1 RT-PCR檢測基因表達：將篩選出的G418抗性克隆（轉染空載體FLAG-pcDNA3.0、轉染FLAG-pcDNA 3.0-iASPP的NIH3T3細胞）及未轉染的NIH3T3細胞培養至對數生長期，用TRIzol試劑提取總RNA，設計上下游引物并行RT-PCR擴增鑒定。上游引物：5′-GTGAA GGAGATGAACGACCCG-3′，下游引物：5′-GGCGCAGTCAGCATAACCC-3′,擴增產物長度為297bp。PCR擴增條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共27個循環，最終72℃延伸10min。PCR反應產物經2%凝膠電泳檢測。

1.2.3.2 Western blotting檢測蛋白表達：細胞裂解液裂解上述對數生長期細胞，加4×SDS上樣緩沖液，煮沸5min。各樣品取等量，進行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，按Western b1otting常規操作依次進行封閉、與抗iASPP單克隆抗體反應，洗滌后與HRP標記的山羊抗小鼠IgG反應，然后按照ECL試劑盒的操作說明進行發光反應。

1.2.4 MTT法檢測 FLAG-pcDNA3.0-iASPP對NIH3T3細胞增殖的影響 將未轉染的NIH3T3細胞、NIH3T3-F LAG-pcDNA3.0-iASPP細胞和NIH3T3-FLAG-pcDNA3.0細胞按每孔1×103個細胞傳代于96孔板，各設6個復孔。24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃繼續孵育4h，棄培養基，每孔加入DMSO150μL，振蕩10min。在490nm波長的酶聯免疫檢測儀上測各組吸光度（OD）值，連續檢測5d。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 重組質粒FLAG-pcDNA3.0-iASPP的酶切鑒定及序列測定 3個重組質粒FLAG-pcDNA3.0-i－ASPP樣本經EcoR I和Xho I雙酶切后，0.8%瓊脂糖電泳可見2713bp的目的條帶（圖1），證明iASPP已經成功插入到FLAG-pcDNA3.0載體中。測序結果（略）經BLAST分析顯示與Genbank中的序列(登錄號：NM_006663.3)CDS區一致。

圖1 重組質粒FLAG-pcDNA3.0-iASPP的雙酶切鑒定Fig1The identification of recombinant plasmid FLAG-pcDNA3.0-iASPP by restriction enzyme digestion

2.2 iASPP在NIH3T3細胞中的表達

2.2.1 RT-PCR檢測結果 轉染細胞經G418持續篩選21d后形成明顯陽性克隆，而未轉染的細胞則全部死亡。將陽性克隆擴大培養后，采用RT-PCR方法檢測轉染細胞中iASPP mRNA的表達。結果顯示：轉染FLAG-pcDNA3.0-iASPP組的NIH3T3細胞在297bp處可見基因iASPP的目的條帶，而未轉染組及轉染空質粒組則未見目的條帶，表明外源iASPP可以很好轉錄（圖2）。

2.2.2 Western blotting檢測結果 Western blotting檢測結果顯示，在轉染FLAG-pcDNA3.0-iASPP的NIH3T3細胞的陽性克隆中，可檢測到相對分子質量為99kD的目的條帶，而轉染空質粒組及未轉染組均未見iASPP蛋白表達（圖3）。

2.3 MTT法檢測FLAG-pcDNA3.0-iASPP對NIH3T3細胞增殖的影響 MTT比色法測定各實驗組在490nm波長處的OD值，取均值繪制折線圖（圖4）。應用SPSS13.0軟件單因素方差分析顯示：轉染Flag-pcDNA3.0-iASPP組增殖速率高于未轉染組和轉染空質粒組，且具有統計學差異，P值分別為0.036、0.022；而未轉染組與轉染空質粒組（FLAG-pcDNA3.0）增殖速率基本一致，兩者無統計學差異（P=0.974）。

圖2 RT-PCR鑒定結果Fig 2 Result of RT-PCR identification

圖3 Western blotting檢測結果Fig 3 Result of Western blotting identification

圖4 MTT法測定不同轉染組細胞增殖情況Fig 4 Cell proliferation were evaluated using MTT assays among different groups

3 討論

p53凋亡刺激蛋白家族（apoptosis stimulating protein of p53，ASPP），是迄今為止發現的最完善、積極的調控p53的基因家族，由3個成員組成：ASPP1、ASPP2和iASPP。ASPP1、ASPP2是p53蛋白的活化子，能特異性的激活p53促凋亡活性，而不影響細胞周期阻滯[7]；iASPP則抑制p53的促凋亡活性，起到類似癌基因的作用，多項研究指出i－ASPP在乳腺癌、白血病、肺癌、垂體瘤、肝細胞癌中存在過表達現象[1,5-6,8]。阻斷iASPP和p53的結合能夠恢復p53的功能，提示iASPP有望作為腫瘤治療靶點[9-13]。

通過iASPP基因siRNA質粒轉染P53野生型白血病細胞株Nalm6和P53基因突變型白血病細胞株K562，發現iASPP mRNA、蛋白表達都有所降低，細胞生長和增殖受到明顯抑制，同時細胞凋亡有所增加[8]。為進一步確認iASPP能否成為白血病治療的一個靶點，聯合化療藥物（柔紅霉素和依托泊苷）對這兩個白血病細胞株進行了實驗，發現化療藥物并不影響iASPP mRNA的表達，但下調i－ASPP mRNA水平能顯著增強化療藥物誘導的凋亡，這種趨勢在Nalm6細胞株中表現得尤為明顯。相似的一項研究亦發現轉染iASPP基因siRNA質粒后iASPP mRNA表達有所降低，細胞凋亡有所增加，且細胞凋亡增加的程度與p53的狀態有關[14]。

本研究采用PCR的方法從源克隆PCMV-i－ASPP中擴增獲得iASPP基因編碼區序列，并亞克隆到真核表達載體FLAG-pcDNA3.0中，經酶切、測序鑒定序列正確，轉染細胞后可檢測到iASPP基因mRNA和蛋白水平表達。iASPP真核表達載體的成功構建使得我們在一定程度上可以了解在iASPP過表達情況下，細胞生物學指標、功能的變化。與化療藥物聯合，還可以分析腫瘤耐藥的可能機制。另外，本研究亦通過用脂質體介導轉染NIH3T3細胞，G418加壓篩選后獲得穩定表達iASPP的細胞系，MTT法比較其與未轉染組和轉染空質粒組的增殖情況，發現穩定表達iASPP細胞系的增殖率明顯增高，初步驗證了iASPP的促細胞增殖活性。

總之，iASPP真核表達載體的成功構建，是iASPP基因siRNA技術的一個重要補充，為進一步開展直接、全面的研究iASPP的生物學功能奠定了基礎。我們今后的研究重點應在于探討其在腫瘤發生中的具體作用機制，進一步分析其作為腫瘤治療新靶點的可行性。

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