PUMA和caspase-3在結(jié)直腸癌中的表達及意義

王文娟，高玉彤

（天津醫(yī)科大學病理學教研室，天津300070）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。關于其發(fā)生機制，目前還不是很清楚，至少部分研究顯示細胞凋亡調(diào)控失常與結(jié)直腸癌的發(fā)生有一定的關系[1]。PUMA是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡調(diào)控基因，屬于Bcl-2家族中的成員，可通過依賴P53途徑或非依賴P53途徑促進細胞凋亡[2]。研究顯示PUMA的表達下降或缺失參與腫瘤發(fā)生，如胰腺癌、惡性黑色素瘤、淋巴瘤[3-4]，關于PUMA在結(jié)直腸癌發(fā)生中作用的研究報道少見。Caspase-3是細胞凋亡通路的關鍵酶之一，在結(jié)直腸癌發(fā)生中的表達情況還有爭議。本研究通過檢測PUMA和caspase-3在結(jié)直腸癌及腺瘤中的表達情況，分析其與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關系，探討兩者在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期為結(jié)直腸癌早期診斷和臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 收集天津醫(yī)科大學總醫(yī)院2006年1月～2008年12月期間手術切除、經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌和腺瘤的標本80例，其中結(jié)直腸癌60例，結(jié)直腸腺瘤20例；選取距離腫瘤10cm以上結(jié)直腸黏膜作為正常對照，共計44例。結(jié)直腸癌患者中男性35例，女性25例；年齡21～81歲，中位數(shù)年齡70.5歲；臨床病理參數(shù)（1）組織學分級：高分化腺癌20例（33.3%）；中分化腺癌33例（55.0%）；低分化腺癌7例（11.7%）。（2）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移28例（46.7%）；無轉(zhuǎn)移32例（53.3%）。（3）Dukes分期：A+ B 33例（55.0%）；C+D 27例（45.0%）。（4）浸潤深度：未侵出漿膜39例（65.0%）；侵出漿膜21例（35.0%）。

1.2 主要試劑 兔抗人PUMA多克隆抗體（濃縮型）購自武漢博士德生物工程公司，工作濃度1∶50；兔抗人caspase-3多克隆抗體（即用型），購自北京中杉金橋生物公司。PV-6000通用型兩步法免疫組化檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化PV兩步法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5min；微波抗原修復，中火，3min×2次，自然冷卻至室溫，PBS液沖洗；3%過氧化氫甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，10min，PBS液沖洗；滴加一抗，4℃冰箱過夜，PBS沖洗；滴加通用型二抗（PV-6000），37℃溫箱孵育40min，PBS沖洗；DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每批染色均設陽性對照和陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 PUMA和caspase-3陽性染色均為胞漿著色，按半定量積分法[5-6]判斷陽性結(jié)果。根據(jù)陽性細胞染色強度及陽性百分率分別計分，染色強度:不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分率：陰性記為0分，陽性細胞≤10%記為1分,11%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分。兩項評分相乘≥2分記為陽性（+），＜2分記為陰性（－）。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，率的比較應用χ2檢驗，相關性分析應用計數(shù)資料列聯(lián)表的相關分析，雙側(cè)檢驗水準，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PUMA在結(jié)直腸癌中的表達 PUMA陽性染色定位于胞漿中，正常結(jié)直腸黏膜組PUMA的表達高于結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組，3組之間表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.183，P<0.01）；正常結(jié)直腸黏膜組與結(jié)直腸腺瘤組之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.247，P<0.05）；正常結(jié)直腸黏膜組和結(jié)直腸癌組之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.475，P<0.01）；結(jié)直腸腺瘤組與結(jié)直腸癌組之間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.019，P>0.05），見表1、圖1a、1b。

表1 PUMA在正常黏膜、腺瘤、結(jié)直腸癌組織中的表達Tab 1 Expression of PUMA in normal mucosa,adenoma and colorectal cancer

圖1 PUMA 在正常黏膜和腺癌中的表達Fig1Expression of PUMA in normal mucosa and adenocarcinoma

2.2 Caspase-3在結(jié)直腸癌中的表達 Caspase-3陽性染色定位于胞漿中，正常黏膜組caspase-3的表達高于結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組，3組之間表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.785，P<0.01）；正常結(jié)直腸黏膜組與結(jié)直腸腺瘤組之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.145，P<0.01）；正常結(jié)直腸黏膜組與結(jié)直腸癌組之間差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12.613，P<0.01）；結(jié)直腸腺瘤組與結(jié)直腸癌組之間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.076，P>0.05），見表2、圖2a、2b。

表2 Caspase-3在正常黏膜、腺瘤、結(jié)直腸癌組織中的表達Tab 2 Expression of caspase-3in normal mucosa,adenoma and colorectal cancer

圖2 Caspase-3在正常黏膜和腺癌中的表達Fig 2 Expression of caspase-3in normal mucosa and adenocarcinoma

2.3 PUMA表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關系 在結(jié)直腸癌中，PUMA的表達與腫瘤的大小有關，腫瘤最大直徑>5cm組陽性表達率低于腫瘤最大直徑≤5cm組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.514，P<0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、分化程度、浸潤深度、臨床分期無明顯相關。見表3。

2.4 Caspase-3表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關系 Caspase-3表達與患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小、臨床分期、浸潤深度無關，在中低分化組略高于高分化組，但差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.846，P>0.05）。見表3。

表3 PUMA和caspase-3蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系Tab 3 The relationship between PUMA,caspase-3expression and clinicopathologic features of colorectal cancer

2.5 PUMA與caspase-3的相關性分析 結(jié)直腸癌中PUMA陰性表達的41例患者中，有18例csapase-3陰性表達，兩者表達呈正相關（r=0.329，P<0.05）。見表4。

表4 PUMA、caspase-3表達的相關性分析Tab 4 The correlative analysis on PUMA and caspase-3expression

3 討論

3.1 PUMA與結(jié)直腸癌 PUMA是2001年Yu、Nakano及Han 3個研究小組同時發(fā)現(xiàn)的促凋亡基因，屬于Bcl-2家族中的BH3亞家族中的一員。PUMA基因定位于19q，主要通過轉(zhuǎn)錄子PUMAα、β發(fā)揮促凋亡的作用，它可依賴P53途徑或非依賴P53途徑促進細胞凋亡。研究顯示，PUMA與腫瘤的發(fā)生有關，有動物實驗發(fā)現(xiàn)，RNA干擾技術通過阻斷P53誘導的細胞凋亡作用，抑制PUMA基因表達，促進Eμ-myc誘導的淋巴瘤的形成，Bim基因缺失小鼠喪失PUMA基因表達后，會加強小鼠淋巴組織增生并向惡性轉(zhuǎn)化。在缺氧誘導的腫瘤模型中，PUMA丟失促成染色體的不穩(wěn)定性，增加腫瘤的發(fā)生機率。研究顯示大約40%的Burkitt’s淋巴瘤出現(xiàn)PUMA基因表達缺失，這可能與DNA甲基化作用有關[7]。Karst等[8]用組織芯片和免疫組化技術研究原發(fā)性黑色素瘤、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤及不典型增生組織中PUMA的表達水平，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性黑色素瘤明顯弱于不典型增生組織，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤PUMA表達弱于原發(fā)黑色素瘤組織，腫瘤組織中PUMA的表達可以作為患者5年生存率的預測指標。陳鑫等[9]應用RT-RCR技術檢測PUMA mRNA在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)PUMA 4種不同剪切體（PUMA-α,-β,-γ及-δ）在癌組織中表達下調(diào)，與癌的發(fā)生呈負相關。

本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中，PUMA在正常黏膜組的表達高于結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌組（P<0.05），結(jié)直腸腺瘤組和結(jié)直腸癌組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），提示PUMA可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生，并在早期階段起作用。PUMA表達率與腫瘤的大小有關，在≤5cm腫瘤組織中陽性率較高（18/44），在＞5cm腫瘤組織中陽性率較低（1/16）,表明PUMA表達減少，腫瘤細胞凋亡減少，體積相對較大。PUMA陽性表達與結(jié)直腸癌其它病理參數(shù)無明顯相關，提示PUMA與結(jié)直腸癌進展及預后關系不大，這與Jansson等[10]的研究結(jié)果基本一致。研究表明，結(jié)直腸癌發(fā)生與正常黏膜隱窩干細胞突變有關，干細胞中APC基因失活會誘發(fā)小鼠腸道腫瘤形成，PUMA依賴P53凋亡途徑清除基因突變的干細胞，抑制腫瘤發(fā)生。此外，炎癥反應是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要因素，免疫細胞釋放的活性物質(zhì)造成細胞DNA損傷，炎癥因子TNF-α及ROS、ER應激反應都可通過P53非依賴途徑誘發(fā)PUMA生成，清除損傷的上皮細胞，防止腫瘤發(fā)生[11]。Qiu等[12]利用(AOM)/dextran sulfate sodium salt model動物模型發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸隱窩干細胞的部位，AOM水平提高了，PUMA基因的表達及PUMA介導的凋亡作用也會增加，而且在APC(Min/+)小鼠模型中，PUMA缺失會促使末端小腸和結(jié)腸自發(fā)性大腺瘤及微腺瘤的形成。我們推測當各種體內(nèi)或體外因素造成正常腸道細胞受損時，PUMA發(fā)揮促凋亡作用，清除受損細胞，抑制腫瘤發(fā)生。如果該途徑受到干擾，則導致腫瘤的發(fā)生。

3.2 Caspase-3與結(jié)直腸癌 Caspsae-3是半胱氨酸蛋白酶家族中的一員，執(zhí)行細胞凋亡的關鍵酶之一，大多細胞凋亡途徑都通過caspase-3引發(fā)細胞凋亡[13]。Caspase-3作為細胞凋亡的最終執(zhí)行者，可能參與多種腫瘤的發(fā)生。Sun等[14]報道肝癌癌旁正常組織caspase-3表達高于肝癌組織，且高分化者caspase-3表達高于低分化者，caspase-3參與肝癌的去分化過程，它與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關。Hsia等[15]研究食管癌發(fā)現(xiàn)，caspase-3高表達可作為判斷食管癌良好預后的指標。在結(jié)直腸癌變過程中，caspase-3的表達情況國內(nèi)外文獻報道不一，仍有爭議。Guan等[16]發(fā)現(xiàn)腺瘤中caspase-3表達顯著高于結(jié)直腸癌組（P<0.05）。也有學者認為caspase-3在結(jié)直腸癌中的表達高于正常黏膜，且與腫瘤復發(fā)相關，尤其以右側(cè)結(jié)腸明顯[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常黏膜-腺瘤-結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)化序列中，caspase-3陽性表達呈下降趨勢，腺瘤組與結(jié)直腸癌組陽性表達低于正常黏膜組（P<0.05），腺瘤組與結(jié)直腸癌組差異無統(tǒng)計學意義，提示caspase-3表達降低使細胞凋亡減少，在結(jié)直腸癌發(fā)生的早期階段發(fā)揮作用。本研究顯示caspase-3在結(jié)直腸癌中陽性表達與患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、臨床分期、浸潤深度無明顯相關，提示caspase-3與結(jié)直腸癌的進展及預后無關。也有文獻報道，caspase-3與結(jié)直腸癌的分化程度有關，癌組織分化程度越高，凋亡活性越強。我們推測研究結(jié)果的不一致可能與樣本量的大小、所選用的研究方法等因素有關。Caspase-3與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關系還需要進一步研究以明確其作用機制。

3.3 PUMA與caspase-3PUMA主要通過促進細胞凋亡發(fā)揮抑癌作用，本研究表明，在結(jié)直腸癌中PUMA與caspase-3呈正相關。無論依賴還是非依賴P53途徑，PUMA通過線粒體通路促進細胞凋亡，PUMA與抗凋亡基因Bcl-2結(jié)合，將促凋亡基因Bax或Bim置換出來，激活Bax或Bim,Bax或Bim形成寡聚體，誘導線粒體釋放細胞色素C,激活procaspase-9和procaspase-3,引起細胞凋亡[18]。因此推測，PUMA表達下調(diào)，caspase-3活性下降，細胞凋亡受抑制，參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明PUMA和caspase-3可能是結(jié)直腸癌發(fā)生過程中的早期事件，但未顯示其參與腫瘤的進展，是否參與結(jié)直腸癌的進展還有待進一步研究，PUMA通過細胞凋亡作用抑制腫瘤發(fā)生，這可能為臨床腫瘤治療提供新的基因靶點。

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