APE1、VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系

沈春燕，穆海玉，王 忱，多 健，佟仲生

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，天津300162；3.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060）

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（APE1/ref-1）是人體內(nèi)一種重要的多功能蛋白，它既是細(xì)胞內(nèi)DNA堿基切除修復(fù)(BER)途徑中的限速酶，又是一種氧化還原因子，可以調(diào)控多種核轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原狀態(tài)，進而影響細(xì)胞的生長和分化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，APE1為一種腫瘤相關(guān)基因，在多種惡性腫瘤中呈過度表達，并與患者預(yù)后相關(guān)[1-3]，但其機制尚不明確，可能與增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性和促進惡性腫瘤的血管生成等因素相關(guān)[4-6]。筆者的前期工作表明APE1與晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的化療耐藥性存在聯(lián)系[7]，因此，我們進一步采用免疫組化法檢測APE1和VEGF在可手術(shù)NSCLC中的表達，同時測定腫瘤內(nèi)微血管密度（MVD），嘗試探討APE1、VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達情況、與血管生成的關(guān)系及其對患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 自2004年1月～2005年1月在武警醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療，臨床資料及隨訪資料完整的肺癌患者共計101例，存檔石蠟標(biāo)本中符合實驗條件的共有78例。其中男47例，女31例，年齡32～77歲，平均56歲。43.59%（34/78）的患者無吸煙史。行肺葉切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)的患者45例，行全肺切除術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)的患者33例。根據(jù)AJCC癌癥分期第6版的臨床分期，其中Ⅱ期53例，Ⅲ期25例。根據(jù)2000年WHO肺和胸膜腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)組織學(xué)證實鱗癌43例，腺癌35例。生存期的計算從手術(shù)日期到末次隨訪日期，或由于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 實驗方法 78例NSCLC組織標(biāo)本經(jīng)過石蠟包埋，切片后應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)法檢測APE1和VEGF的表達情況，血管內(nèi)皮特異標(biāo)記物CD34標(biāo)記并計數(shù)腫瘤MVD。鼠抗人APE1單克隆抗體購于Novus Biologicals公司，兔抗人VEGF單克隆抗體和鼠抗人CD34單克隆抗體購于Santa Cruz公司，免疫組化試劑盒購于北京中杉生物有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，用已知陽性切片做陽性對照。

1.3 結(jié)果判定 APE1陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞漿及部分胞核，VEGF則主要表達于細(xì)胞漿。在高倍光鏡下選取10個視野，觀察計數(shù)1000個細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)記分：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；染色強度記分：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項相加為最終判定結(jié)果：1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為 (++)，6～7分為 (+++)，其中-和+記為低表達，而++和+++記為高表達。CD34陽性染色定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈現(xiàn)棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇團。MVD計數(shù)方法為在高倍鏡(×200)下計數(shù)每一視野的微血管數(shù)目，取平均值即為MVD。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性采用spearman相關(guān)分析，計量資料分析采用t檢驗，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗，采用COX回歸模型進行多因素生存分析。P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APE1、VEGF表達特點及其與MVD計數(shù)的關(guān)系 APE1陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，主要在肺癌細(xì)胞的胞漿表達，部分分布于胞核，見圖1；VEGF主要表達于細(xì)胞漿，呈棕黃色至深棕色顆粒狀，見圖2。APE1、VEGF的高表達率分別為：78.2%（61/ 78）和64.1%（50/78）。表1示Spearman等級相關(guān)分析，APE1與VEGF表達在NSCLC中呈正相關(guān)（r=0.382，P=0.001）。同時，經(jīng)t檢驗顯示：APE1蛋白高表達組MVD值（27.56±8.14）明顯高于低表達組（22.17±8.96）（t=2.365，P=0.021），VEGF蛋白高表達組MVD（28.59±7.68）值明顯高于低表達組（22.45±8.76）（t=3.222，P=0.002）。

圖1 APE1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(×100)Fig1APE1expression in NSCLC(×100)

圖2 VEGF在非小細(xì)胞肺癌中的表達 (×100)Fig2VEGF expression in NSCLC(×100)

表1 NSCLC中APE1與VEGF表達之間的關(guān)系Tab 1 Correlation between APE1and VEGF expression in NSCLC

2.2 APE1、VEGF及MVD計數(shù)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系 APE1在吸煙者、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中表達顯著升高（P=0.047和P=0.016），VEGF在腫瘤直徑大于等于5cm組、中低分化程度組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達顯著升高（P=0.011、P=0.022和P=0.035），MVD值與腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P= 0.025和P=0.029），見表2。

2.3 APE1及VEGF表達與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析顯示，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、APE1表達、VEGF表達與生存率相關(guān)（P= 0.000、P=0.000、P=0.003和P=0.009），見圖3～6。進一步行COX多因素分析顯示，腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和APE1表達是影響本組非小細(xì)胞肺癌患者生存率的獨立危險因素（P=0.000、P=0.000和P=0.027）；回歸系數(shù)為正值，表示隨因素程度的增加，患者的死亡危險度（RR）相對增加，見表3。

表2 APE1、VEGF表達及MVD計數(shù)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between APE1,VEGF expression,MVD and clinicopathologic features

圖3 78例非小細(xì)胞肺癌腫瘤大小和總生存期的關(guān)系Fig 3 Relationship between the tumer size and overall survival in 78NSCLC patients

圖4 78例非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存期的關(guān)系Fig 4 Relationship between the lymph node matastasis and overall survival in 78NSCLC patients

圖6 78例非小細(xì)胞肺癌VEGF表達和總生存期的關(guān)系Fig 6 Relationship between the expression of VEGF and overallsurvival in 78NSCLC patients

表3 NSCLC預(yù)后因素的多因素COX回歸分析Tab 3 COX regression modal multivariate analysis for prognosis in NSCLC

3 討論

原發(fā)性肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率分別居男性惡性腫瘤的首位和女性惡性腫瘤的第2位，而死亡率在男性和女性惡性腫瘤死因中均為第1位[8]。因此，很多學(xué)者致力于探討有關(guān)肺癌新基因的治療靶點和通路，嘗試新的研究策略，提高治療效果，而APE1則是近年來的研究熱點之一。

APE1基因位于人第14號染色體，編碼蛋白約37kD，含有318個氨基酸殘基，其N末端主要為氧化還原調(diào)控區(qū)，而C末端主要為核酸內(nèi)切酶活性區(qū)[9]。APE1是多功能的DNA堿基切除修復(fù)途徑的限速酶，是細(xì)胞DNA放射性和化學(xué)性損傷的重要修復(fù)因子，其過表達可以促進堿基切除修復(fù)完成。同時，APE1也是一種重要的氧化還原因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種重要的核轉(zhuǎn)錄因子如HIF-1α、P53、NF-κB等蛋白的表達[9-10]，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性。腫瘤血管形成是一個非常復(fù)雜的過程，它與許多基因的改變、多種細(xì)胞因子的正負(fù)性調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境的改變均有關(guān)系，與惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。VEGF是經(jīng)典的促血管形成因素之一，可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其分化而形成新的血管，并增加血管通透性，在腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[11]。

本研究顯示，APE1在NSCLC中的高表達率為78.2%，且與吸煙和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這也證實BER修復(fù)基因在吸煙等因素刺激下可以表達上調(diào)，與Yoo等[12]的報道相似。VEGF在本組NSCLC中的高表達率為64.1%，并與腫瘤大小、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。經(jīng)Spearman相關(guān)分析表明，二者表達存在相關(guān)性。HIF-1α是目前較為肯定對VEGF存在調(diào)控的核因子，而APE1對VEGF的調(diào)控也極有可能通過這一通路實現(xiàn)。因此，這一機制可能為：APE1高表達可以增強HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，而HIF-1α則可以增強VEGF mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性[13-14]，從而促進VEGF過表達，我們認(rèn)為APE1可能參與腫瘤血管生成機制，促進血管生成。

MVD是較為常用的評價血管生成的指標(biāo)，因此我們采用CD34抗體免疫標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計算本組病例標(biāo)本的MVD。在本研究中，APE1高表達組的MVD，高于低表達組；VEGF高表達組的MVD，亦高于低表達組，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。APE1及VEGF高表達的腫瘤中，血管生成則更為活躍。大多數(shù)研究認(rèn)為MVD值高提示腫瘤更易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，是預(yù)后不佳的指標(biāo)。

同時，在單因素生存分析中我們也發(fā)現(xiàn)了APE1、VEGF低表達者均較高表達者具有更長的生存期（P=0.003和P=0.009），但進一步將各危險因素帶入COX模型進行多因素分析則發(fā)現(xiàn)APE1表達是影響NSCLC患者預(yù)后的獨立因素，而在小樣本調(diào)查中一些學(xué)者亦認(rèn)為VEGF并不一定成為NSCLC的獨立預(yù)后因素，但可能和其他預(yù)后因素互相影響[15]，與我們的實驗結(jié)論不盡相同。這說明APE1的過表達提示NSCLC患者的預(yù)后不佳，而其促進血管生成以及和VEGF表達的相關(guān)性則是可能的通路之一。

本研究表明在NSCLC中，APE1與VEGF的表達存在相關(guān)性，APE1過表達可能促進腫瘤組織血管的生成，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。同時，APE1作為多功能的生物大分子，仍可能存在其他通路影響惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，值得我們進一步研究，而以之為靶點的治療亦可能是未來的研究方向。

［1］ Puglisi F,Barbone F,Tell G,et al.Prognostic role of Ape/Ref-1subcellularexpressioninstageI-IIIbreastcarcinomas[J].OncolRep, 2002,9(1):11

［2］ Ouellet V,Le Page C,Guyot MC,et al.SET complex in serous epithelial ovarian cancer[J].Int J Cancer,2006,119(9):2119

［3］ Al-Attar A,Gossage L,Fareed KR,et al.Human apurinic/apyrimidinic endonuclease(APE1)is a prognostic factor in ovarian,gastro-oesophageal and pancreatico-biliary cancers[J].Br J Cancer, 2010,102(4):704

［4］ Wang D,Zhong ZY,Li MX,et al.Vector-based Ape1small interfering RNA enhances the sensitivity of human osteosarcoma cells to endostatin in vivo[J].Cancer Sci,2007,98(12):1993

［5］ Yang ZZ,Chen XH,Wang D.Experimental study enhancing the chemosensitivity of multiple myeloma to melphalan by using a tissue-specific APE1-silencing RNA expression vector[J].Clin Lymphoma Myeloma,2007,7(4):296

［6］ Wang D,Xiang DB,Yang XQ,et al.APE1overexpression is associated with cisplatin resistance in non-small cell lung cancer and targeted inhibition of APE1enhances the activity of cisplatin in A549cells[J].Lung Cancer,2009,66(3):298

［7］ 王忱，趙曉輝，史玉榮，等.APE1與P-gp在晚期非小細(xì)胞肺癌中的表達及其臨床意義[J].實用癌癥雜志，2010,25(2):146

［8］ 楊玲，李連弟，陳育德，等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發(fā)病死亡的估計與預(yù)測[J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2005,22(4):218

［9］ Evans AR,Limp-Foster M,Kelley MR.Going APE over ref-1[J]. Mutat Res,2000,461(2):83

［10］Luo M,Delaplane S,Jiang A,et al.Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1in cancer and endothelial cells:small-molecule inhibition of the redox function of Ape1[J].Antioxid Redox Signal,2008,10(11):1853

［11］Korpanty G,Smyth E,Sullivan LA,et al.Antiangiogenic therapy in lung cancer:focus on vascular endothelial growth factor pathway [J].Exp Biol Med(Maywood),2010,235(1):3

［12］Yoo DG,Song YJ,Cho EJ,et al.Alteration of APE1/ref-1expression in non-small cell lung cancer:the implications of impaired extracellular superoxide dismutase and catalase antioxidant systems[J].Lung Cancer,2008,60(2):277

［13］Ziel KA,Campbell CC,Wilson GL,et al.Ref-1/Ape is critical for formation of the hypoxia-inducible transcriptional complex on the hypoxic response element of the rat pulmonary artery endothelial cell VEGF gene[J].FASEB J,2004,18(9):986

［14］Jackson AL,Zhou B,Kim WY.HIF,hypoxia and the role of angiogenesis in non-small cell lung cancer[J].Expert Opin Ther Targets,2010,14(10):1047

［15］Ozbudak IH,Ozbilim G,Kucukosmanoglu I,et al.Vascular endothelial growth factor expression and neovascularization in nonsmall cell lung carcinoma[J].Int J Surg Pathol,2009,17(5):390