清咽滴丸抗柯薩奇病毒B3,B5的實驗研究

遲 瑋，陳 霞，王小龍，褚玉晶，李志媛，李曉眠

（天津醫科大學微生物學教研室，天津300070）

清咽滴丸是一種高效、速效中藥制劑，具有疏風清熱、解毒利咽、消腫止痛的作用。在現代藥理學研究中顯示出對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有一定的抑菌作用[1]。同其它一些中藥口含片相比，清咽滴丸的抑菌效果較顯著[2]，且穩定性好，無不良反應[3]。柯薩奇病毒B3（CVB3）是病毒性心肌炎的主要病原[4-5]，病毒持續感染可導致擴張型心肌病[6-7]。柯薩奇病毒B5（CVB5）主要引起腦炎、心肌炎、心包炎、腹膜炎、肝炎、睪丸炎、皰疹性咽峽炎等，偶見皮疹[8]。本研究旨在探討清咽滴丸在體外（細胞水平及血清水平）對CVB3、CVB5的治療作用，為篩選新型抗病毒藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞 CVB3（Nancy株），CVB5（Kauchker株），Vero細胞株均為本實驗室保存。

1.1.2 藥物 清咽滴丸由天津中新藥業集團股份有限公司第六中藥廠生產，國藥準字號Z10930004；病毒靈由山西太原藥業有限公司生產，國藥準字號H14023460。

1.1.3 實驗動物 雄性健康SD大鼠6只，體重均約250g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所醫學實驗動物中心。

1.1.4 主要試劑和儀器 RPMI-1640培養基(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(Sigma)；二甲基亞砜（天津大學科威公司）；96孔培養板(Costar)；CO2培養箱 (美國Thermo Forma，3111型)；倒置顯微鏡(德國Zeiss，Axiorert 200)；酶標儀（Multiskan Mk3，Thermo Labsystems）。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度測定 根據Reed-Muench法計算CVB3、CVB5的半數組織感染劑量（TCID50）。實驗用病毒濃度為100TCID50。

1.2.2 藥物毒性測定 取對數生長期的Vero細胞100μL/孔接種在96孔板，置于37℃，5%CO2培養箱中24h，待細胞長成單層，棄培養液。連續倍比稀釋藥液，濃度分別為2×10-2g/mL、1×10-2g/mL、5×10-3g/mL、2.5×10-3g/mL、1.25×10-3g/mL、6.25×10-4g/mL、3.125×10-4g/mL、1.56×10-4g/mL、7.81×10-5g/mL、3.91×10-5g/mL，每稀釋度4孔，另設正常細胞對照組。培養72h，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞變化，記錄CPE[9]。

1.2.3 細胞水平上清咽滴丸對CVB3、CVB5的作用

1.2.3.1 治療法：在病毒吸附細胞2h后加入清咽滴丸最大無毒濃度的0.5倍、1倍、5倍、10倍、20倍濃度藥液[10]，每個濃度4孔，另設有病毒對照組、病毒靈對照組、正常細胞對照組。培養72h，MTT法[11]測定細胞存活率，計算抑制率。病毒抑制率(%)=(藥物處理孔A值-病毒對照孔A值)/(細胞對照孔A值-病毒對照孔A值)×100%。

1.2.3.2 同時法：將清咽滴丸最大無毒濃度的0.5倍、1倍、5倍、10倍、20倍濃度藥液分別與病毒混合，接種到培養板上，每個濃度4孔，另設病毒對照組、病毒靈對照組、正常細胞對照組。培養72h，MTT法測定細胞存活率，計算抑制率。

1.2.4 血清水平上清咽滴丸對CVB3、CVB5的作用

1.2.4.1 含藥血清的制備：清咽滴丸按100mg/kg（相當于成人臨床推薦劑量的6倍）給大鼠灌胃，給藥前禁水禁食12h。灌胃前第1次內眥采血，灌胃后25min第2次采血，以后每隔20min采血1次，每次取血約1.5mL，共6次。無菌分離血清，56℃，30min滅活后，將每個時間點血清樣本分別用細胞維持液稀釋成1:2、1:4、1:6、1:10、1:16，-20℃凍存。

1.2.4.2 最適血清濃度測定：不同時間點不同稀釋度的含藥血清按每孔100μL加到單層Vero細胞孔中，每個濃度設4孔，另設正常血清對照組、病毒對照組、病毒靈對照組。培養72h，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞變化，記錄CPE。

1.2.4.3 含藥血清對CVB3、CVB5的抑制作用：將每個時間點血清樣本分別用細胞維持液稀釋成1∶10，按每孔100μL加到單層Vero細胞孔中，每濃度設4孔，同時分別用100μL 100TCID50CVB3、CVB5感染細胞，另設正常血清對照組、病毒對照組、病毒靈對照組。培養72h，MTT法測定細胞存活率，計算抑制率。

1.3 統計學方法 采用統計軟件SPSS 11.0對數據進行ANOVA單因素方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 Vero細胞形態學變化 正常Vero細胞為梭形或多邊形，排列整齊緊密，呈上皮樣，胞漿清楚，折光性好。CVB3或CVB5接種于Vero細胞上第1～2天出現細胞病變，細胞變小呈橢圓形或樹枝狀，細胞內顆粒增多，折光性變差，3d后幾乎全部固縮、死亡、脫落，懸浮在培養液表面。清咽滴丸、病毒靈及含藥血清均是直接使細胞變小變圓，高濃度時直接抑制細胞增殖、導致細胞迅速死亡。

2.2 病毒滴度 CVB3：TCID50=10-7.4，CVB5：TCID50= 10-7。

2.3 藥物毒性 不同濃度的清咽滴丸接種于細胞72h后，7.81×10-5g/mL及其以下濃度未見細胞出現明顯形態變化，故清咽滴丸的最大無毒濃度（TC0）為7.81×10-5g/mL。同理可知，病毒靈的TC0為6.25×10-4g/mL。

2.4 細胞水平上清咽滴丸對CVB3、CVB5的作用

2.4.1 清咽滴丸對CVB3的作用 由表1可知在同時法中加入TC0（7.81×10-5g/mL）清咽滴丸組能明顯抑制病毒增殖，與病毒對照組差別有統計學意義（P<0.05），其余4個清咽滴丸組與病毒對照組差別無統計學意義（P>0.05）。鏡下觀察的結果跟統計結果一致，說明清咽滴丸有抑制CVB3感染細胞的作用，且7.81×10-5g/mL清咽滴丸組效果最好。

表1 不同給藥方法清咽滴丸抗CVB3的病毒抑制率（%）Tab 1 Inhibition ratio of Qingyan diwan to CVB3through different given methods（%）

在治療法中加入5TC0（3.91×10-4g/mL）清咽滴丸組對病毒的治療作用最好，與病毒對照組差別有統計學意義（P<0.05），其余4個清咽滴丸組與病毒對照組差別無統計學意義（P>0.05）。鏡下觀察的結果跟統計結果一致，說明清咽滴丸有治療CVB3感染細胞的作用，且3.91×10-4g/mL清咽滴丸組效果最好。

2.4.2 清咽滴丸對CVB5的作用 由表2可知在同時法中加入TC0（7.81×10-5g/mL）和0.5TC0（3.91×10-5g/mL）清咽滴丸組能明顯抑制病毒增殖，與病毒對照組差別有統計學意義（P<0.05），其余3個清咽滴丸組與病毒對照組差別無統計學意義（P>0.05）。鏡下觀察的結果跟統計結果一致，說明清咽滴丸有抑制CVB5感染細胞的作用，且7.81×10-5g/mL清咽滴丸組效果最好。

在治療法中加入0.5TC0（3.91×10-5g/mL）清咽滴丸組對病毒的治療作用最好，與病毒對照組差別有統計學意義（P<0.05），其余4個清咽滴丸組與病毒對照組差別無統計學意義（P>0.05）。鏡下觀察的結果跟統計結果一致，說明清咽滴丸有治療CVB5感染細胞的作用，且3.91×10-5g/mL清咽滴丸組效果最好。

表2 不同給藥方法清咽滴丸抗CVB5的病毒抑制率（%）Tab 2 Inhibition ratio of Qingyan diwan to CVB5through different given methods（%）

統計結果顯示同種給藥方法中，清咽滴丸抑制CVB3和CVB5增殖或治療CVB3和CVB5的感染的結果差異無統計學意義（P>0.05）。

2.5 血清水平上清咽滴丸對CVB3、CVB5的作用

2.5.1 最適血清濃度測定 由觀察的細胞病變情況可知，同一濃度不同時間含藥血清的作用效果類似，含清咽滴丸血清在稀釋度為1:10以上時對細胞的毒性作用明顯減輕，故最適清咽滴丸血清濃度為1:10。

2.5.2 含藥血清對CVB3、CVB5的抑制作用 含藥血清在65min組和105min組時抑制CVB3增殖顯著，細胞存活良好，與病毒對照組差別有統計學意義（P<0.05），但與病毒靈對照組差別無統計學意義（P>0.05）；其余4組含藥血清與病毒對照組差別無統計學意義（P>0.05）。含藥血清在65min組、85min組和105min組時抑制CVB5增殖顯著，細胞存活良好，與病毒對照組差別有統計學意義（P< 0.05），但與病毒靈對照組差別無統計學意義（P> 0.05）；其余3組含藥血清與病毒對照組差別無統計學意義（P>0.05）。提示清咽滴丸在大鼠體內藥物濃度的峰值在65～105min之間，且抑制病毒增殖的效果與病毒靈幾乎沒有差別。見表3。

表3 含藥血清對CVB3、CVB5的抑制作用Tab 3 Inhibited effect of drug-contained serum to CVB3and CVB5

3 討論

柯薩奇病毒屬小核糖核酸病毒科，腸道病毒屬。柯薩奇B組病毒是引起感冒、皰疹性咽炎、無菌性腦膜炎、病毒性心肌炎、心包炎等多種疾病的病原，經呼吸道、消化道傳播。由該組病毒引起的心肌炎、心包炎、無菌性腦膜炎等疾病死亡率都很高，對人群潛在危險很大。目前，常用的抗病毒藥病毒靈雖然可有效抑制病毒復制，但病毒靈屬核苷類似物，毒性較大，甚至有致畸作用。因此，尋找更加安全有效的抗病毒藥物勢在必行。

清咽滴丸是治療咽喉疾病的良藥，主選牛黃清熱解毒為君藥，青黛清熱解毒涼血、薄荷疏風清熱、冰片利咽散火止痛，三藥輔牛黃為臣藥；訶子入肺經，利咽散火，止咳解毒治失音為佐藥；甘草清熱利咽，調和諸藥，益氣和中為使藥[12]。諸藥合用具有疏風清熱、解毒利咽、消腫止痛功效，用于治療風熱喉痹、咽痛、咽干、口渴或微惡風、發熱、咽部紅腫、舌邊尖紅等急、慢性咽炎等癥。

根據以上的實驗結果，細胞水平實驗證明清咽滴丸具有很強的直接殺滅CVB3和CVB5的作用，并且對CVB3和CVB5的治療作用效果顯著。在一定范圍內清咽滴丸對CVB5的抑制率隨藥物濃度的降低而增強。

中藥血清藥理學是指將中藥或中藥復方經口給動物灌服一定時間后采集動物血液，分離血清，用含有藥物成分的血清進行體外實驗的一種實驗技術[13]。該方法可以在某種程度上克服中藥本身理化性質的不確定因素對實驗結果的影響。以上的實驗結果證明，在一定范圍內，隨著血藥濃度的增加，其對細胞的毒性作用增強。通過比較同一濃度梯度下，不同時間段含藥血清的抑制作用可知，清咽滴丸在大鼠體內藥物濃度的峰值在65～105min之間。

同時發現，病毒靈對于CVB3和CVB5的抑制作用及治療作用均很顯著。而清咽滴丸與病毒靈的抑制作用及治療作用幾乎沒有差別，但最適血清濃度測定中CPE結果表明一定濃度的清咽滴丸對Vero細胞的毒性遠小于病毒靈，提示用安全有效的中藥代替病毒靈治療病毒具有可行性，擁有美好的前景。

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