替米沙坦對OLETF大鼠自發(fā)性2型糖尿病的干預(yù)作用

鄭喜蘭，田鳳石，雒 瑢，趙紫琴，姚瑞棟

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市公安醫(yī)院內(nèi)科，天津 300050）

單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）屬于趨化因子超家族C-C亞族，主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，是介導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活和趨化的重要介質(zhì)，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由外周血液循環(huán)進(jìn)入脂肪組織使其激活、分泌多種炎性因子如IL-6、TNF-α等。脂肪組織的慢性炎癥在肥胖相關(guān)的胰島素抵抗（IR）中發(fā)揮著重要作用[1]，而IR又是2型糖尿病（T2DM）發(fā)病的關(guān)鍵因素。本實驗旨在研究替米沙坦對早期高脂喂養(yǎng)OLETF大鼠睪周脂肪組織MCP-1mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討替米沙坦在減輕IR、預(yù)防糖尿病方面的作用。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)及分組 4周齡雄性 OLETF（Otsuka long-evans tokushima fatty） 大鼠 30只和 LETO（Long-evans tokushima otsuka）大鼠12只均以標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)喂養(yǎng)4周。自由獲取水和食物。8周齡OLETF大鼠飼高脂飼料，LETO大鼠飼標(biāo)準(zhǔn)飼料。22周齡根據(jù)口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）2h血糖和體重將未發(fā)生糖尿病的30只OLETF大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只：（1）替米沙坦組（T）：高脂飲食加替米沙坦。（2）二甲雙胍組（M）：高脂飲食加二甲雙胍。（3）高脂對照組（O）：高脂飲食。LETO大鼠12只，為對照組（NC）。每日灌胃1次，T組替米沙坦5mg/kg，M組二甲雙胍100mg/kg，其余兩組等量蒸餾水灌胃。48周齡股動脈放血處死大鼠，取血5mL，分離血清，取睪周脂肪組織。

1.2 實時熒光定量PCR檢測MCP-1mRNA表達(dá)水平 提取睪周脂肪組織總RNA（2μg），逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。MCP-1上游引物Pf,mcp-1：5′-AAC CAG CCA ACT CTC ACT GAA GCC A-3′，MCP-1下游引物Pr,mcp-1：5′-GAT TCT CTT GTA GTT CTC CAG CCG A-3′，GAPDH上游引物Pf,GAPDH：5′-TCG TGG AGT CTA CTG GCG TCT T-3′，GAPDH下游引物Pr,GAPDH：5′-CAG TCT TCT GAG TGG CAG TGA T-3′。反應(yīng)體系：25μL體系中加入SYBR Green Master Mix 12.5μL，Pf,mcp-1（10μmol/L）和Pr,mcp-1（10μmol/L）各2μL，cDNA 2.5μL，ddH2O6μL。反應(yīng)條件（Bio-Rad公司Chromo 4）：95℃預(yù)變性60s，95℃變性15s，59.4℃（MCP-1）或58.8℃（GAPDH）退火60s，共39個循環(huán)。采用相對定量方法，根據(jù)實時熒光定量PCR反應(yīng)所獲得的CT值來決定基因表達(dá)水平，基因表達(dá)量以2-△△CT的值進(jìn)行統(tǒng)計，△CT1表示每只大鼠睪周脂肪組織目的基因（MCP-1）和內(nèi)參基因（GAPDH）CT值的差值，即CT,MCP-1-CT，GAPDH，△CT2表示O組目的基因（MCP-1）和內(nèi)參基因（GAPDH）CT值差異的均值，即CT，MCP-1（o）-CT,GAPDH(o)，△△CT即△CT1-△CT2。

1.3 血清指標(biāo)檢測 血清MCP-1、游離脂肪酸（FFA）采用ELISA法，空腹血糖（FBG）采用葡萄糖氧化酶法，胰島素（FINS）采用放射免疫法測定。胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=（FINS×FBG）/22.5。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗，以±s表示。多組間資料比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗，兩兩比較使用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組間睪周脂肪組織MCP-1mRNA表達(dá)水平的比較 MCP-1mRNA表達(dá)量NC組為0.21±0.08，O組為1±0.3，M組為0.17±0.19，T組為0.20±0.12，F(xiàn)=6.044，P<0.01。見圖1。

圖1 大鼠睪周脂肪組織MCP-1mRNA的表達(dá)Fig 1 The expression of MCP-1mRNA in adipose tissue

2.2 各組間血清 MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR比較 T組和M組MCP-1均低于O組（P<0.05）。T組FFA低于O組和M組（P<0.01），且T組FBG及HOMA-IR均低于O組（P<0.05）。T組的FINS低于M組（P<0.05）。見表1。

表1 大鼠各組間血清MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR比較(±s)Tab 1 Comparison of MCP-1,FFA,FBG,FINS and HOMA-IR among groups of rats(±s)

表1 大鼠各組間血清MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR比較(±s)Tab 1 Comparison of MCP-1,FFA,FBG,FINS and HOMA-IR among groups of rats(±s)

與NC組比較★P<0.05，★★P<0.01；與O組比較●P<0.05，●●P<0.01；與M組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別NC O M T例數(shù)12101010MCP-1(pg/mL) 33.85±8.9243.90±6.73★★34.74±6.35●34.64±7.60●FFA(mmol/L) 2.53±1.595.31±1.84★★6.33±2.72★★2.85±0.68●●▲▲FBG(mmol/L) 5.83±0.6815.40±7.11★★14.67±6.77★★9.98±5.85●FINS(UIU/mL) 15.30±4.0825.96±9.49★32.61±15.59★20.88±10.58▲HOMA-IR 4.04±1.4317.75±10.09★★19.49±8.13★★10.04±8.58●▲T2DM發(fā)病率（%）08010040

3 討論

OLETF大鼠是一種比較公認(rèn)的自發(fā)性T2DM動物模型，其膽囊收縮素（CCK）受體1缺陷[2]，導(dǎo)致了該大鼠多食、肥胖。有研究表明高脂飲食可誘導(dǎo)IR的發(fā)生，從而誘發(fā)糖尿病[3]。為此本研究采用高脂喂養(yǎng)OLETF大鼠，在48周齡時檢測發(fā)現(xiàn)O組睪周脂肪組織MCP-1mRNA的表達(dá)明顯增加，血清MCP-1、FFA、FBG、FINS及HOMA-IR也明顯高于NC組，同時80%大鼠發(fā)生糖尿病。Kazuhiko等[4]在研究中也發(fā)現(xiàn)飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠脂肪組織中MCP-1mRNA的表達(dá)是正常大鼠的7.2倍，血漿中的MCP-l水平也明顯升高。肥胖小鼠白色脂肪組織是MCP-1的主要來源[5]，且MCP-1與IR密切相關(guān)，它可以降低胰島素刺激的脂肪細(xì)胞糖的攝取，并影響脂肪細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，且通過激活核因子-κB（NF-κB）促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。

有實驗表明對高脂喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠給予10mg/(kg·d)纈沙坦可以提高其糖耐量水平，并直接降低小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞的浸潤和MCP-1的表達(dá)[6]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)替米沙坦干預(yù)后的高脂喂養(yǎng)的OLETF大鼠睪周脂肪組織MCP-1mRNA表達(dá)明顯下降，同時血清MCP-1、FFA及FBG水平也顯著降低，大鼠的IR得到改善，其糖尿病的發(fā)病率也有所下降，而二甲雙胍雖能降低OLETF大鼠睪周脂肪組織MCP-1mRNA表達(dá)及血清MCP-1水平，但對FFA、FBG、FINS、HOMA-IR及糖尿病的發(fā)生率均無影響。表明替米沙坦可能通過減少MCP-1的表達(dá)而改善IR，達(dá)到預(yù)防糖尿病的作用。其可能機(jī)制為：脂肪組織具有完整的腎素血管緊張素系統(tǒng)，可以產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ，后者通過激活NF-κB誘導(dǎo)脂肪組織MCP-1的表達(dá)[7]，而替米沙坦是一種長效血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，通過阻斷血管緊張素Ⅱ的作用而減少脂肪組織MCP-1的表達(dá)，同時替米沙坦還有激活過氧化物酶體增殖物激活受體1（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ）的作用[8]，而PPARγ的激活可以增加胰島素的敏感性，二者共同作用可以減輕IR，最終達(dá)到早期預(yù)防糖尿病的效果。

以往替米沙坦作為降壓藥物而應(yīng)用于臨床，而本研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦可通過減少脂肪組織中MCP-1mRNA的表達(dá)而起到減輕IR的作用，對早期預(yù)防糖尿病有積極的意義。因此，隨著對替米沙坦的深入研究，其對糖尿病的早期預(yù)防作用有望應(yīng)用于肥胖且有糖尿病傾向人群的干預(yù)，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療。

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