反硝化聚磷菌富集、篩選及其特性

賈學斌，王 強，杜 叢，孫靜文，姜欣欣，王春麗，馬 放

(1.哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱，mafang@hit.edu.cn; 2.黑龍江大學建筑工程學院，150080哈爾濱)

隨著我國廢水排放總量的日益增加，由氮磷污染物引發(fā)的水華、赤潮已經對飲用水安全造成極大危害，因此如何有效的去除水體中氮、磷，防止水體富營養(yǎng)化已成為我國最主要水污染防治問題之一.反硝化除磷工藝由于集反硝化過程與除磷過程為一體而成為廢水生物處理技術領域的研究熱點.反硝化除磷工藝中功能菌群是反硝化聚磷菌，由其在缺氧條件下實現(xiàn)了同步脫氮和除磷的目的［1］.一些學者曾經認為脫氮過程中產生的硝酸鹽和亞硝酸鹽可能抑制除磷過程［2-3］，但Kuba(1994)［4］發(fā)現(xiàn)反硝化除磷菌的除磷能力與普通除磷菌相似，還能利用NO3-作為電子受體氧化細胞內儲存的PHB，從而去除廢水中氮素，在除磷同時進行反硝化，簡化了脫氮除磷工藝. Hu J Y［5］等人也發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮在較低的質量濃度條件下，可以和氧氣、硝態(tài)氮一樣成為供除磷菌選擇的電子受體.近年來，國內外學者相繼對反硝化聚磷菌的種屬組成進行了研究，由于DPB是兼性厭氧菌，培養(yǎng)條件相對復雜、操作困難且培養(yǎng)時間長［6］，篩選工作量大且效率低的原因，反硝化聚磷菌純培養(yǎng)物研究較少，目前獲得反硝化聚磷菌純菌鮮見報道［7］.因此如何充分利用DPB優(yōu)越性提高生物脫氮除磷工藝的處理效率，首要解決的問題是反硝化聚磷菌的分離以及篩選，反硝化聚磷菌純菌的研究具有十分重要的意義［8］.

本文利用控制A2SBR進水及運行方式馴化普通活性污泥，實現(xiàn)了反硝化聚磷菌的快速富集，并從自控SBR脫氮除磷系統(tǒng)分離得典型的反硝化聚磷菌，考察了所篩菌株的生長情況，和聚磷菌、反硝化菌進行了初步復配，提供了一種快速有效的富集篩選反硝化聚磷菌方法，為反硝化除磷脫氮機理的進一步研究奠定基礎.

1 試驗

1.1 反硝化聚磷菌富集裝置及運行方式

從生物脫氮除磷的機理分析來看，生物脫氮除磷工藝基本上包括厭氧、缺氧、好氧3種狀態(tài)，這3個不同的工作狀態(tài)可以在空間上進行分離，也可以在時間上進行分離［9-10］.本實驗采用按時間順序進行的SBR反應器作為富集裝置.

試驗采用的是兩個直徑25 cm、高50 cm圓柱形SBR反應器，工作容積為19 L.試驗裝置如圖1所示.

反硝化聚磷菌的富集采用高注水比和兩段進水的運行方式降低COD與硝酸鹽共存的可能性，強化聚磷菌的選擇優(yōu)勢.同時在進水質量濃度一定的情況下提高污泥的營養(yǎng)負荷，加快細菌增殖的速度，達到快速富集DPB的目的.

反硝化聚磷菌的富集采用圖2所示運行方式，反應器每天運行3個周期，每個周期兩次進水、兩次排水，注水比0.67(進排水體積與工作容積之比).在富集期間不排泥，厭氧段開始進入只含乙酸鈉COD為250 mg/L的配水;缺氧段開始進入含PO43-和的配水，進水P質量濃度約為19 mg/L，質量濃度根據需要加入.

圖1 反硝化除磷SBR反應器裝置圖

圖2 A2SBR反硝化聚磷菌富集馴化的運行方式

1.2 反硝化聚磷菌的分離、篩選

聚磷菌是在厭氧和好氧條件下都能生存的兼性菌，稀釋混合平板法分離效果要比稀釋涂布平板法效果好，對于聚磷菌的分離采用稀釋混合平板法比較有效［11］.在分離反硝化聚磷菌過程中，采用稀釋混合平板法.

根據已有資料顯示，DPB的分離比較困難，可能需要某些生長因子才能生長.一般在其他菌群存在時，DPB才可能生長，因此，前期并未采用含磷培養(yǎng)基來選擇富集，初步分離采用適于大多數微生物生長繁殖的普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.缺磷培養(yǎng)基:無水乙酸鈉5 g;Na2HPO4·2H2O 0.023 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCl2·H2O 0.2 g; (NH4)2SO42.0 g;蒸餾水1 000 mL;微量元素1 mL.含磷培養(yǎng)基:無水乙酸鈉5.0 g;KH2PO40.125 g;MgSO4·7H2O 0.5 g;CaCl2·H2O 0.2 g; (NH4)2SO42.0 g;蒸餾水1 000 mL;微量元素1 mL(45 mg/L NO3--N由KNO3提供，根據試驗需要加入).

篩選試驗以磷為檢測指標，菌株在缺磷培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)24 h后，測量其培養(yǎng)后菌液OD值，用無菌水調節(jié)OD值一致后加入富磷培養(yǎng)基，定時取樣測定-P質量濃度的變化，考察各株菌對于培養(yǎng)液中的吸磷效率，輔以硝酸鹽還原試驗、PHB染色、Poly-P顆粒染色鏡檢試驗，初步篩選出硝酸鹽還原陽性且聚磷效果較好的菌株，測量方法參見表1.進一步試驗是以硝氮為指標，考察DPB的同步脫氮除磷效能，將加有KNO3的富磷培養(yǎng)基高溫滅菌后分裝在密閉容器中，取30℃培養(yǎng)24 h后飽和菌液調節(jié)OD值一致后加入，充氮除氧，采用磁力攪拌器進行混合，定時取樣測定P-P和-N質量濃度的變化，測量方法見表1.最終得到聚磷效果穩(wěn)定、高效具有反硝化功能的菌株DPB.

表1 水質分析項目與方法

1.3 聚磷菌的復配

由于污水處理系統(tǒng)的復雜性，微生物的純培養(yǎng)無法完全再現(xiàn)實際脫氮除磷系統(tǒng)情況，故經常出現(xiàn)純培養(yǎng)與實際觀測不一致的情況.實際的反應器是由各種微生物組成的一個生態(tài)系統(tǒng)，并不僅僅是依靠某一種菌單獨起作用，而是需要各種功能菌相互作用共同完成系統(tǒng)功能.為了初步模擬反應器中微生物的相互作用對聚磷的影響，實驗對經過篩選出的菌進行隨機兩兩復配.方法如下:用無菌水調節(jié)待復配菌株菌液OD值一致后等比例加入含KNO3的富磷培養(yǎng)基的密閉容器，然后置于30℃培養(yǎng)，充氮除氧，采用磁力攪拌器進行混合，定時取樣測定PO43--P和-N質量濃度的變化，對比培養(yǎng)前后單株菌的脫氮除磷效率.

2 結果與分析

2.1 反硝化聚磷菌富集

在不到半個月的富集馴化期內，通過高注水比和兩段進水的特定運行方式保障反硝化除磷菌在系統(tǒng)中的快速增殖.隨著富集運行時間的增加，凈吸磷量總體呈上升趨勢，系統(tǒng)的凈吸磷量逐漸升高.缺氧段去除的硝酸鹽也逐漸增加(見圖3、4)，反應器的凈吸磷增加到約4 mg/L，缺氧段去除的硝酸鹽達58 mg/L，去除率達100%，系統(tǒng)達到明顯的反硝化除磷效果.

圖3 反硝化聚磷菌富集期系統(tǒng)凈吸磷量

圖4 反硝化聚磷菌富集期系統(tǒng)硝氮去除

在富集馴化末期，A2SBR系統(tǒng)趨于穩(wěn)定，將反應器改為厭氧/缺氧/沉淀的方式運行，監(jiān)測運行周期內反硝化除磷系統(tǒng)中可溶性磷質量濃度、COD質量濃度和硝酸鹽質量濃度的去除情況(見圖5).

在厭氧階段，COD質量濃度整體呈下降趨勢，磷質量濃度逐漸增加，表現(xiàn)出明顯的釋磷現(xiàn)象，在厭氧階段末期，體系中磷質量濃度增加到24.9 mg/L.進入缺氧階段的第1小時內，檢測到了強烈的反硝化吸磷現(xiàn)象，每克MLSS吸磷平均速率為4.89 mg/h，每克MLSS反硝化平均速率為6 mg/h，單位PO43--P可消耗的-N量為1.22 mg/mg.經過4.5 h的缺氧階段，系統(tǒng)中磷質量濃度和硝酸鹽質量濃度分別下降到0.47 mg/L和3.4 mg/L，系統(tǒng)除磷和脫氮率高達95%和94%，去除的碳氮比為3.8、碳磷比為22.周期試驗缺氧段吸磷過程硝酸鹽氮的消耗量和磷的吸收量呈現(xiàn)了較好的線性關系，此時反應系統(tǒng)已經存在大量能以NO3--N為電子受體進行吸磷的反硝化聚磷菌，DPB成為SBR系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種.高注水比和兩段進水的特定運行方式對反硝化除磷菌的富集馴化快速有效，可使反硝化除磷系統(tǒng)在較短的時間內完成富集過程.

圖5 A2SBR富集馴化末期周期試驗

2.2 反硝化聚磷菌的分離、篩選

反硝化聚磷菌是將攝磷和反硝化這兩個不同的生物過程在同一體內完成的一種兼性厭氧菌［12］.硝酸鹽還原性陽性(生物反硝化脫氮)是細菌的一種無氧呼吸形式;異染顆粒(細菌超量吸磷)是細菌的一種能量貯備形式，它們是兩種并不沖突的細菌生化特性.硝酸鹽還原性為陽性且產氣，菌體內含有異染顆?；蚓?β-羥基丁酸顆粒，既能反硝化脫氮，又能厭氧釋磷;在好氧(O2)或缺氧(NO3-)狀況下超量吸磷的細菌即可稱為反硝化聚磷菌［13］.基于此，對已分離純化的備選菌種進行了吸磷試驗、硝酸鹽還原產氣試驗及異染顆粒和PHB顆粒染色輔助檢驗(見表2)，來實現(xiàn)篩選得到同步脫氮除磷效果都較好DPB.

表2 篩選結果 %

2.3 反硝化聚磷菌的鑒定

利用Shelock脂肪酸鑒定系統(tǒng)，結合部分菌株生理生化試驗、菌株個體形態(tài)、菌落形態(tài)觀察對所篩菌株進行菌屬綜合鑒定，將菌株鑒定到屬，結果見表3.

早期研究認為不動桿菌屬為除磷系統(tǒng)中典型的優(yōu)勢菌種，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬只是少數菌屬，并不占優(yōu)勢，只占總量的1% ～10%，而其他微生物的除磷能力更不容忽視，優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)和氣單胞菌屬(Aerodomonas).氣單胞菌屬能夠過量攝取廢水中的磷酸鹽形成聚磷酸鹽胞內物質;假單胞菌屬具有除磷菌的共性，即在厭氧條件下釋放磷和在好氧條件下過量攝取磷，并能夠累積聚磷酸鹽［14-15］.試驗所分離鑒定的菌種涵蓋不動桿菌、假單胞菌屬、氣單胞菌屬、粘液奈瑟菌、弗氏檸檬酸桿菌，篩選結果與已有研究較為一致.

表3 聚磷菌鑒定結果

2.4 菌種復配

對經過前期篩選聚磷效果較好的菌16、19，有同步反硝化能力的b11、a5、b204，反硝化率較高的GS進行隨機復配.從圖6可以看出，6種復配方案中b11×a5、b11×b204、19×GS、b204× 16的效果較好，都達到了氮、磷同步去除要求.其中24 h復配效果最好的是b204×16，吸磷率為85.78%，脫氮率為75.02%，相對于b204單菌除磷效果 67.09%，復配后吸磷效果突出，達85.78%，除磷效果得到顯著提高，復配后脫氮效果雖有所下降，但也維持在較高的75.02%水平，達到了同步脫氮除磷的目的.復配前16號菌雖然除磷效果很好(94.86%)，但對于脫氮卻沒有貢獻，而復配后在保持較高除磷效果的同時也達到了較高的脫氮效果.說明二者在生態(tài)關系上互補，通過各自的代謝活動進行功能上的互補，從而實現(xiàn)了同步脫氮除磷效果的提高，具有作為脫氮除磷生物強化菌劑的潛在價值.

圖6 復配結果

復配方案中16×GS的效果最差.兩株菌的單株處理效果都不錯，其中的16號菌除磷效果很好，而好氧反硝化菌GS具有較高的脫氮能力.但菌株復配不但沒能提高處理效果，復配后反而失去除磷能力，脫氮能力也有所下降.分析原因可能是GS菌株代謝過程產生了某種抑制物，從而使菌16的生長受到抑制，并導致菌16的最終死亡.在這個過程中16號菌與GS產生競爭，對GS也產生了不利影響，引起脫氮效果的下降.GS菌株是聚磷菌16的抑制菌群，GS菌對于除磷是有害的，復配并未提高處理效果.

3 結論

1)厭氧/沉淀排水/缺氧/沉淀排水和較高注水比的運行方式避免了C、N共存的情況，對快速富集反硝化聚磷菌十分有利，能在較短時間使反硝化聚磷菌迅速成為優(yōu)勢菌.

2)實驗以磷為檢測指標，綜合磷吸收試驗、硝酸鹽還原試驗、PHB染色、Poly-P顆粒染色的分離篩選方法，從富集馴化A2SBR反應器中分離得到效果較好的反硝化聚磷菌，鑒定為 a5: Aeromonas-ichthiosmia;b204:Pseudomonasstutzeri;b31:Citrobacter freundii;b11:Neisseria -mucosa.

3)b204和菌16組合方案可以作為潛在脫氮除磷生物強化菌劑.b204與聚磷菌和反硝化菌復配，復配效果最好的是 b204和 16，吸磷率為85.78%，脫氮率為75.02%，相對于單菌株均表現(xiàn)出了較好的脫氮除磷效果.復配效果最差的是聚磷菌16和反硝化菌GS組合，復配后不具有吸磷能力，脫氮率為70.09%，相對于單菌株處理能力降低，聚磷菌和反硝化菌兩類菌的復配未能達到同步脫氮除磷目的.

［1］ WACHTMEISTER A，KUBA T，LOOSDRECHT van M C M，et al.A sludge characterization assay for aerobicand denitrifying phosphorus removing sludge［J］. Wat Res，1997，31(3):471-478.

［2］ JENKINS D，TANDOI V.The applied microbiology of enhanced biological phosphate removal accomplishments and needs［J］.Water Res，1991，25:1471-1478.

［3］ STARKENBURG van W，RENSINK J H，RIJS G B J. Biological P-removal:state of the art in the Netherlands［J］.Water Sci Technol，1993，27:317-328.

［4］ KUBA T，LOOSDRECHT van M C M，HEIJNEN J J. Effect of cyclic oxygen exposure on the activity of denitrifyingphosphorus removing bacteria［J］.Wat Sci Tech，1996，34:33-40.

［5］ HU J Y，ONG S L，NG W J，et al.A new method for characterizing denitrifying phosphorus removal bacteria by using three different types of electron acceptors［J］.Wat Res，2003，37(14):3463-3467.

［6］ AHN J，DAIDOU T，TSUNEDA S.Characterization of denitrifying phosphate-accumulating organisms cultivated under different electron acceptor conditions using polymerase chain reaction-denaturing gradient gelel ectrophoresis assay［J］.Water Research，2002，36:403-412.

［7］ ZENG R J，YUAN Z，KELLER J.Model based analysis of anaerobic acetate up take by a mixed culture of polyphosphate accumulating and glycogen accumulating organisms［J］.Biotechnol Bioeng，2003，83 (3):293-302.

［8］ WANG L J，LI W，KANG L.Bioremediation of eutrophicated water by Acinetobacter Calcoaceticus［J］. Bull Environ Contam Toxicol，2007，78:527-530.

［9］ AHN Y H，SPEECE R E.Elutriated acid fermentation of municipal primary sludge［J］.Wat Res，2006，40 (11):2210-2220.

［10］ ZENG J，YUAN Z，KELLER J.Effects of solids concentration，pH and carbon addition on the production rate and composition of volatile fatty acids in prefermenters using primary sewage sludge［J］.Wat Sci Tech，2006，53(8):263-269.

［11］ 王春麗，馬放，王立立.耐低溫聚磷菌的研究［J］.哈爾濱工業(yè)大學學報，2007，39(18):1327-1330.

［12］ LEMAIRE R，MEYER R，TASKE A，et al.Identifying causes for N2O accumulation in a lab-scale sequencing batch reactor performing simultaneous nitrification，denitrification and phosphorus removal［J］. J Biotechnol，2006，122(1):62-72.

［13］ 任世英，肖天.菌體內多聚物的染色方法［J］.海洋科學，2005，29(1):59-63.

［14］ LU H，OEHMEN A，VIRDIS B，et al.Obtaining highly enriched cultures of candidatus phosphate accumulating bacteria through altering carbon sources［J］.Wat Res，2006，40(20):3838-3848.

［15］ HE S，GU A，MCMAHON Z K D.Fine-scale differences between accumulibacter-like bacteria in enhanced biological phosphorus removal activated sludge［J］.Wat Sci Tech，2006，54(1):111-117.