秸稈降解菌株的誘變選育及發酵條件的研究

黃曉梅，楊 謙，陳秀玲，范金霞，徐 杰

(1.哈爾濱工業大學生命科學系，150001哈爾濱，yangq@hit.edu.cn;2.東北農業大學園藝學院，150030哈爾濱)

采用微生物降解將纖維素轉化成乙醇、單細胞蛋白、有機酸等已成為纖維素資源再生利用研究的熱點.自然界當中能分解纖維素的生物主要是真菌類及部分細菌，以木霉、曲霉、青霉的能力最突出［1-3］，綠色木霉具有較強的分解天然纖維素的能力，目前被認為是最有應用前景的纖維素酶生產菌之一［4］，但霉菌纖維素酶活力較低，一直是阻礙其大規模生產應用的瓶頸問題［5］.目前的解決方法一是通過菌種的篩選、選育、基因工程［6］和細胞工程等手段提高纖維素酶的產量和活力，二是改變天然纖維素的結構，從而提高其對酶的敏感性.其中菌種選育是獲得高效纖維素分解菌株的關鍵，也是纖維素酶生產的基礎.紫外線誘變和化學誘變是最簡單、方便又有效的誘變選育高產菌的方法，國內外科研工作者一直都在進行這方面研究，但目前還缺乏高效降解秸稈生產纖維素酶的菌株.因此，通過紫外線和硫酸二乙酯的復合誘變方法，篩選纖維素酶活高的綠色木霉變異株，并對其利用秸稈發酵條件進行研究，為利用秸稈工業化生產纖維素酶和應用提供依據.

1 試驗

1.1 菌種

綠色木霉(T.viride)CICC 13038購自中國工業微生物菌種保藏中心.

1.2 培養基

斜面和平板培養基:馬鈴薯培養基(PDA).

篩選培養基:羧甲基纖維素鈉7.5～10 g/L，(NH4)2SO41.4 g/L，脲 0.3 g/L，KH2PO42.0 g/ L，CaCl20.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，蛋白胨0.5～1.0 g/L，吐溫80 1.0～2.0 g/L，FeSO4· 7H2O 5.0mg/L，ZnSO4·7H2O 1.4mg/L，MnSO4· H2O 1.6 mg/L，CoCl22.0 mg/L，pH 5～6［7］，剛果紅0.2 g/L，瓊脂20 g/L.

種子液培養基:馬鈴薯液體培養基(PD).

發酵產酶培養基:蛋白胨3 g/L，硫氨2 g/L，酵母膏0.5 g/L，KH2PO44 g/L，CaCl2·2H2O 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，吐溫 80 0.2 g/L，碳源23.5 g/L［8］，根據研究需要，變動培養基的成分.

1.3 誘變和篩選

1.3.1 孢子懸浮液制備

取活化培養4 d的綠色木霉平板，用無菌水沖洗下孢子，通過3層無菌擦鏡紙過濾至盛有玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩15 min，使孢子分散，稀釋成為1×106個/mL的孢子懸浮液.

1.3.2 復合誘變

硫酸二乙酯處理:在制備好的孢懸液中分別加入體積分數為1%～2%的硫酸二乙酯混勻，于30℃條件下黑暗振蕩處理10～30 min，取50 μL孢懸液均勻涂布于PDA平板上.

紫外線照射:在暗室的無菌工作臺上用30 W的紫外燈，距離30 cm照射涂布孢子的平板1～3 min，置于30℃培養箱黑暗培養5 d.并且實驗設有硫酸二乙酯和紫外線單獨處理的單因素誘變處理.

1.4 初篩和復篩

挑取單菌落于剛果紅篩選培養基上初篩.選取纖維素透明圈與菌落直徑比值大的菌落，進行3次初篩，菌株傳代10代，以備進一步復篩.

初篩后的菌株按培養基體積分數的5%接入1×106個/mL的孢懸液于液體篩選培養基，進行復篩.整個培養期測定羧甲基纖維素酶活(CMCase)、濾紙酶活(FPase)、β-葡萄糖苷酶活(βGase).

1.5 發酵產酶培養

種子液制備:以PD為培養基，按培養基體積分數1%接種1×106個/mL的孢懸液，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養48 h.

發酵產酶培養:按產酶培養基體積分數的10%接種種子液，在30℃、160 r/min條件下振蕩培養，定時取樣測定發酵液中纖維素酶活，每個處理均重復3次.

1.6 纖維素酶活力測定

纖維素粗酶液制備:發酵液經5 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液.

纖維素酶活的測定:CMCase、FPase、βGase測定方法參照文獻［9］，0.5 mL粗酶液加入底物1.5 mL，反應后加入2 mL DNS，煮沸10 min，測定540 nm的吸光值.測定時間為5 d.

酶活單位:用國際單位(U)，即在實驗條件下，每小時產生1 mg葡萄糖為1個酶活單位［10］.

1.7 發酵條件優化

1)碳源對產酶的影響.選擇10種碳源，組成24種組合(見表2)，兩種碳源以1∶1比例混合，按質量分數2.35%加入發酵產酶培養基中，每個處理均重復3次，下同.

2)碳源比例對產酶的影響.選擇最優組合，兩種碳源按7∶0，6∶1，5∶2，4∶3，3∶4，2∶5，1∶6和0∶7比例混合，加入液體產酶培養基中.

3)氮源對產酶的影響.根據得到的最佳碳源比例，選擇11種氮源(見表3)，按質量分數0.2%對氮源種類進行優化，得到最佳無機氮源和有機氮源.

4)氮源比例對產酶的影響.按質量分數0.2%將無機和有機氮源按6∶0，5∶1，4∶2，3∶3，2∶4，1∶5和0∶6比例加入培養基中，研究產酶的變化，確定最佳氮源比例.

5)碳氮比例對產酶的試驗.在碳質量分數2.35%情況下，碳氮比例為9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1，進行最佳產酶碳氮比優化.

6)碳氮質量分數對產酶的影響.在碳氮比例確定的情況下，比較碳氮質量分數為1.33%、2%、2.67%、3.33%、4%、4.67%、5.33%、6%、6.67%、7.33%時產酶的變化，得到最佳產酶的碳氮質量分數.

7)起始pH對產酶的影響.用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配置不同pH值(3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、5.8、6.2、6.4、6.8、7.2、7.6)的培養液，作為起始培養pH值，確定產酶最佳的酸堿條件.

8)溫度對產酶的影響.將接種的液體培養基置于20、24、26、28、30、32、34和38℃環境中培養，比較溫度對產酶的影響.

9)發酵時間對產酶的試驗.從發酵的第2天開始，每隔24 h測定一次酶活，直至第9天結束.比較不同發酵時間產酶的變化.

2 結果與分析

2.1 突變株的篩選

剛果紅纖維素平板透明圈篩選法可用于初步判定纖維素酶活性高低，產酶越多，透明圈越大，產酶越快，透明圈出現越早［8］.從誘變后培養5 d的平板上挑取430個單菌落，經過3次剛果紅纖維素平板透明圈法初篩選出25個菌株.

透明圈大小直接反映了酶活性高低，但不能完全代表菌株產酶能力，因此，必須進行液體發酵復篩.通過搖瓶產酶培養，結果表明:整個培養周期內不同菌株酶的活性有較大差異，酶活的高峰也不盡相同.經過差異顯著性分析(F=93.24，df=6，P＜0.01)(見表1)，有6個菌株的纖維素酶活顯著高于原始出發菌株的酶活，其中，h157菌株產酶最佳，CMCase比出發菌株提高72.53%、FPase提 高 42.18%、βGase提 高85.15%.通過誘變育出6株穩定、高產纖維素酶的綠色木霉突變菌株，均為復合誘變選育得到的.達到了菌種改良的目的.

表1 復篩菌株與出發菌株纖維素酶活力比較

2.2 發酵條件優化

2.2.1 碳源對產酶的影響

纖維素酶是誘導酶，不同的底物產纖維素酶活性不同.天然纖維中含有大量的纖維素，對纖維素酶的產生有一定誘導作用.以麩皮、稻草、玉米桿為主要底物，在24種碳源組合中(表2)，纖維素酶活差異較大，稻草、玉米稈、麩皮纖維性碳源的組合，生產纖維素酶效果明顯優于含單糖、二糖等可溶性碳源組合.其中稻草/玉米稈的CMCase、FPase和βGase最高，其次是麩皮/玉米稈、麩皮/稻草，其他組合酶活較低.原因可能一是纖維性碳源組合在測定酶活時正是產酶高峰期，二是麩皮、稻草、玉米桿組成成分復雜，含有適合菌體生長的營養成分及有較豐富的適合菌株產酶的生長因子.只有碳源既滿足菌體生長需要也能滿足其產酶需要時才能產生較多的纖維素酶.通過碳源對產酶的影響研究，確定稻草/玉米稈組合是綠色木霉h157最適合產酶的碳源.

表2 碳源對綠色木霉h157產纖維素酶的影響U·mL-1

2.2.2 碳源比例對產酶的影響

碳源除供菌體生長外，還是微生物發酵過程中的誘導物和分解底物.麩皮、稻草、玉米稈組成成分復雜，促進菌體生長和誘導菌體產酶的能力不同，因此，碳源的比例是產酶的關鍵因素.由圖1可以看出，不同碳源比例CMCase、FPase變化較大，βGase變化較小.稻草和玉米稈比例為6∶1時CMCase最高，FPase在6∶1至4∶3時變化不大，以后呈下降趨勢.βGase高峰期出現在5∶2時，但在6∶1至5∶2時變化不大，以后緩慢下降，綜合考慮，對于h157菌株最佳產酶的稻草和玉米稈比例為6∶1.

圖1 碳源比例對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

2.2.3 氮源種類對產酶的影響

氮源的種類和性質也是影響酶活力和產率的重要因素，氮源通過影響酶蛋白前體的形成，來調控酶的合成［11］.本實驗采用的11種無機和有機氮對h157產酶的影響結果如表3所示，不同的氮源對酶活影響較大，氨態氮比硝態氮有利于綠色木霉產生纖維素酶，可能與其代謝類型有關.其中，NH4Cl比(NH4)2SO4的CMCase略高，但FPase和βGase則(NH4)2SO4比NH4Cl高，在研究的有機氮中蛋白胨和豆餅粉的 CMCase、FPase和βGase較高，但豆餅粉比蛋白胨價格低廉，綜合考慮，無機氮源和有機氮源分別選擇(NH4)2SO4和豆餅粉.

表3 氮源對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響U·mL-1

2.2.4 無機氮和有機氮比例對產酶的影響

無機氮和有機氮比例是影響菌體生長和產酶的關鍵因素之一，兩種氮源的比例對產酶的影響作用見圖2，以無機氮源(NH4)2SO4為單獨氮源比以有機氮源豆餅粉為單獨氮源時酶活高，隨著(NH4)2SO4與豆餅粉比例的增加纖維素酶活力先上升后下降，當(NH4)2SO4與蛋白胨比例為4∶2時，βGase達到高峰，(NH4)2SO4與豆餅粉比例為3∶3時，CMCase和FPase達到最高峰，綜合考慮，(NH4)2SO4與豆餅粉比例為3∶3有利于CMCase、FPase和βGase的提高.

圖2 氮源比例對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

2.2.5 碳氮比例對產酶的影響

碳氮比例是影響菌體的生長和酶合成的重要因素之一，碳氮比例對綠色木霉產酶的影響作用見圖3，隨著碳氮比的增加纖維素酶活力先上升后下降，碳氮比例在8∶1和7∶1時，CMCase、FPase和βGase的變化幅度不大，碳氮比為8∶1時FPase最高，比例為7∶1時CMCase和βGase最高，綜合考慮碳氮比例為7∶1有利于提高h157的酶活力.

圖3 碳氮比例對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

2.2.6 碳氮質量分數對產酶的影響

碳氮質量分數不但影響菌體生長和產酶，更影響培養液中含氧量.碳氮質量分數對產酶的影響作用見圖4，隨著碳氮質量分數增加纖維素酶活力先上升后下降，碳氮質量分數在3.3%時，CMCase和βGase最高，FPase較高，當質量分數達到4.0%時，FPase最高，但CMCase和βGase下降幅度較大，因此，發酵時選擇碳氮質量分數為3.3%有利于產酶.

圖4 碳氮質量分數對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

2.2.7 pH值對產酶的影響

微生物在最適pH值條件下，生長迅速，代謝旺盛，發育良好.pH值過高或過低，微生物均不能很好地生長發育，嚴重時導致死亡［12］.同時，pH值還影響酶的穩定性和活性.pH值對h157菌株產纖維素酶的影響作用見圖5，pH值在4.8～5.8 CMCase變化不大，pH值在4.8～5.2 FPase最高，pH值在4.8～5.6 βGase變化不大.綜合考慮，pH為5.2時有利于產纖維素酶.

圖5 pH值對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

2.2.8 培養溫度對產酶的影響

溫度是影響微生物機體最重要的因素之一.不但影響菌體的生長，還影響產酶的量.從圖6中可以看出，CMCase、βGase和 FPase在28℃時達到最高，30℃時CMCase和FPase緩慢下降，而βGase快速下降.所以，28℃是最適合綠色木霉h157產酶的培養溫度.

2.2.9 培養時間對產酶的影響

在培養過程中酶活變化如圖7所示，隨著時間的推移，纖維素酶活由低到高，然后又下降，CMCase、βGase在4 d時達到最高值，FPase在5 d時達到最高值，4～5 d是產酶的高峰期，為縮短生產周期，最佳收獲酶的時間為4 d.

圖6 培養溫度對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

圖7 培養時間對綠色木霉h157菌株產纖維素酶的影響

3 討論

隨著分子生物學方法的不斷進步，近年來出現了一些新的菌種選育方法［13-14］，但誘變育種作為一種簡便易行而且快速的選育方法，至今仍被廣泛應用.目前工業中的優良高產菌株絕大部分都是以這種方法獲得.特別是對遺傳背景不很清楚的微生物，誘變育種更是必不可少.單一誘變劑只誘變菌株的DNA某一個或是幾個位點進行突變，誘變出來的高產菌株很容易恢復突變，長期使用誘變劑還會產生誘變劑“疲勞效應”、菌種生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢等現象.而復合誘變具有協同效應，正突變菌株的遺傳比較穩定，誘變效果明顯.本研究采用紫外線和硫酸二乙酯對綠色木霉進行誘變，獲得的6株高產菌種均為復合誘變菌株，與Mahesh等［15］的研究結果相似.由于纖維素酶為一種分泌型誘導酶，碳源影響其纖維素酶的分泌.

4 結論

1)采用復合誘變方法處理綠色木霉(T. viride)菌株，得到6株穩定高產纖維素酶的綠色木霉(T.viride)突變株.并對其液體發酵條件進行了研究，為利用秸稈工業化液體發酵生產纖維素酶提供了菌株和工藝參數.

2)綠色木霉h157產纖維素酶的最適宜碳源是稻草和玉米稈，最佳比例為6∶1，最佳氮源為(NH4)2SO4和豆餅粉，最佳比例為1∶1，最適碳氮比為7∶1，碳氮質量分數為3.3%，產酶適宜pH為5.2，最佳產酶溫度為28℃，最佳產酶時間為4 d.

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