城市生活垃圾除臭酵母的篩選與鑒定

許麗娟，魏小武，孫翔宇，陳 薇，賀月林

(湖南省微生物研究所，湖南長沙 410009)

城市生活垃圾治理是目前我國城市面臨的最嚴重的環境問題之一。我國城市生活垃圾年清運量約為1.5億t，除少部分焚燒、堆肥或回收利用外，絕大部分被運送到填埋場進行處置。這些城市固體廢棄物在轉運、堆放處理過程中產生大量臭氣［1］。惡臭氣體不僅污染空氣，對生態環境造成影響，還會導致人、畜疾病的傳播，影響居民的正常生活和身體健康［2］。筆者通過對城市生活垃圾除臭酵母的篩選及鑒定，獲得無害、高效的除臭酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

試驗菌種是從城市生活垃圾中分離、純化出來的具有一定除臭效果的酵母菌，從中優選出3株，分別為 J1、J2、J3。生活垃圾取自瀏陽垃圾填埋場。

1.2 培養基

分離純化用麥芽汁培養基［3］，培養用PDA培養基［4］。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的初篩

按10%接種量接入所試菌株于發臭垃圾中，以自來水作為對照，分別于接種后24h、48h、72h使用便攜式氨氣檢測儀NBX80－NH3檢測，初步判斷各菌株的除臭效果，對經便攜式檢測儀測定有除臭能力的微生物進行復篩實驗。

1.3.2 菌株的復篩

取18ml菌液于2L大燒杯中，加入500mg/L的氨水2ml;再往大燒杯中放入裝有20ml 0.005N硫酸吸收液的50ml小燒杯，大燒杯蓋上雙層塑料薄膜密封。以等量的無菌水作為對照，每個處理重復3次，置于30℃的培養箱中培養。24h后，取出小燒杯檢測氨的濃度。氨的測定采用納氏試劑比色法［5］。

1.3.3 酵母菌的鑒定

對篩選出的脫氨作用最強的菌株，通過形態學觀察并結合一些生理學試驗來進行鑒定。

1.3.3.1 菌落和菌體形態學觀察

將新培養的酵母接于PDA平板上，置于30℃恒溫培養箱中培養3d，觀察菌落形態;用接種環以無菌操作法挑取菌落少許，制成水浸片，用顯微鏡觀察細胞形態。

1.3.3.2 菌的生理生化特性

糖類發酵試驗［6］。往試管內注入12.5%的豆芽汁3.2ml，并于每支試管內放入一倒置的杜氏小管，試管口包扎好后，115℃滅菌20min備用。分別于上述每支試管內加入10%葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖糖液0.8ml，靜置2h，使杜氏管內外的糖液均勻擴散。將J3菌分別接種于含糖試管中，置30℃恒溫箱內培養3d后觀察，杜氏管內有氣泡存在則說明J3菌可發酵該種糖類。

硝酸鹽利用試驗［7］。①將測試酵母菌進行饑餓培養。把活化好的菌株接種在4ml無菌碳源基礎培養基中，25℃培養5～7d，以消耗細胞內多余的氮源，防止出現假陽性結果。②制備碳源基礎平板培養基。取11.7g酵母碳源基礎培養基，20g純化瓊脂粉，加1000ml蒸餾水，加熱將瓊脂粉熔化后經115℃滅菌30min，冷卻至大約45℃時倒入預先已加入1ml饑餓培養后的酵母細胞懸液的平板中，混勻后靜置，凝固后放在25℃培養箱內數小時，使平板表面干燥，然后把少量所測氮源化合物點在平板上。點置試劑后的平板在25℃下培養2～3d，觀察結果，陽性反應者在所點試劑處或周圍有酵母菌落生長。

產生類淀粉化合物試驗［6］。將菌株J3劃線接于PDA固體培養基中，置于28℃溫箱內培養，待長好后，向平板上傾入盧哥氏 (Lugo1)碘液，若酵母菌落周圍呈現藍色，則為陽性。

產酸試驗［6］。在含碳酸鈣的PDA斜面上接種酵母菌，置于30℃恒溫箱中培養10d后觀察，能產酸的酵母菌能使碳酸溶解而導致培養基呈現透明。

尿酶試驗［8］。取新培養的酵母菌，接種于作水解尿素試驗的瓊脂斜面上，28℃培養。5～7d后，如瓊脂斜面上呈淡紅色，則此酵母能分解尿素。

2 結果與分析

2.1 初篩實驗

對分離出的數株菌株進行了初步的降氨實驗，結果發現有3株菌株表現出較好的除臭作用。且根據感觀判斷，J3菌株除臭能力最強，J2菌株略優于J1菌株，但初篩實驗只是一個簡單的定性實驗，還需要作進一步的定量實驗以判斷各菌株除臭能力的強弱。

2.2 復篩實驗

將初篩試驗中有除臭作用的3株菌株做進一步的復篩實驗，以確定各菌株降氨能力的大小，復篩實驗結果見圖1。實驗結果表明，24h內，J1、J2、J3的脫氨率分別為65%、60%、85%，其中J3對氨的去除率最高，除臭效果也最穩定。復篩實驗結果與初篩實驗基本相符，但不難看出初篩實驗也存在一定的局限性，在初篩實驗中J2的除臭效果要優于J1，但復篩實驗正好相反，因此，只有將初篩與復篩方法相結合才能獲得高效脫臭菌株。

2.3 菌株的形態學觀察

對J3菌株的菌落及菌體形態進行了觀察。從圖2、圖3可見，在PDA固體培養基上J3菌株菌落圓形，濕潤光滑，中間凸起，邊緣整齊，易挑起，顏色乳白色;光學顯微鏡下可見細胞橢圓形，細胞的生殖方式為芽殖。

圖2 J3菌株的菌落特征

圖3 J3菌株的菌體形態

2.4 生化試驗

在形態學分析的基礎上，對該菌株進行了進一步的生理生化實驗，實驗結果如表1所示。結果表明，J3菌株糖類發酵、硝酸鹽試驗、產類淀粉試驗及產酸試驗均呈陰性，尿酶試驗呈陽性，按J·Lodder(1970)酵母分類學鑒定的方法進行酵母的分類，將其歸為擲孢酵母。

表1 J3菌株的生理生化結果

3 結論

城市生活垃圾在轉運、堆放處理過程中產生大量臭氣，造成嚴重的環境污染。臭氣中對人畜健康影響最大的有害氣體主要是氨氣和硫化氫。本試驗以氨的釋放量作為判定菌株除臭能力的一個指標，采用初篩與復篩相結合的方法，從垃圾中分離篩選出了一株能明顯降低氨氣釋放量的J3菌株，其對氨的去除率達80%以上。通過對J3菌株的菌落特征及菌體形態學觀察，結合菌株的生理生化實驗，初步確定J3菌株為擲孢酵母 (Sporobolomyces roseus)。

［1］石磊，邊炳鑫，趙由才，等.城市生活垃圾衛生填埋場惡臭的防治技術進展 ［J］.環境污染治理技術與設備，2005，6(2).

［2］單奇華，俞元春，傅利劍，等.除臭酵母的篩選及其除臭機理［J］.南京林業大學學報，2005，29(4).

［3］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗 (第3版) ［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［4］胡開輝.微生物學實驗［M］.北京:中國林業出版社，2004.

［5］吳小平，鄭耀通.除臭微生物的篩選［J］.福建輕紡，2002，(1).

［6］陳彬，魯緋，王夫杰，等.醬油增香發酵用耐鹽酵母菌的生理生化特性分析及菌種鑒定 ［J］.中國釀造，2010，(11).

［7］徐軍，羅惠波，崔德寶，等.大曲中酵母菌的分離及其鑒定［J］.釀酒，2008，35(3).

［8］ 趙斌，何紹江.微生物學實驗 ［M］.北京:科學出版社，2002.