APE1/Ref-1在腫瘤治療中的應用前景

多 健，韓秀鑫 綜述，應國光，王國文 審校

（天津醫科大學腫瘤醫院骨與軟組織腫瘤科，教育部乳腺癌防治重點實驗室，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060）

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1/氧化還原因子-1（apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1，APE1/Ref-1）是生物體中一種重要酶類，是一個多功能蛋白。APE1在DNA堿基切除修復途徑（BER）中作為人類中最主要的AP（脫嘌呤／脫嘌啶）內切酶，占到AP內切酶活性總體的95%，是保護細胞免除多種DNA損傷藥物毒性作用的必須酶。同時APE1在真核生物多個基因的轉錄中發揮重要的調控作用，是多個基因轉錄的共同調控因子[1]。APE1自1991年兩個不同的研究機構發現其DNA修復活性和氧化功能以后，目前關于其文獻有300多篇，發現其在不同的生物研究領域都有重要作用。在過去的研究中，半數的研究集中于其生化功能，作用機制及其蛋白水平的轉錄調控功能。近來研究發現其在不同腫瘤組織中表達水平及細胞內定位不同，并參與腫瘤的發生發展，有可能成為腫瘤治療的一個新的分子靶點，因此對APE1與腫瘤關系的深入研究對提高腫瘤的診治水平有著重大意義。

1 APE1/Ref-1的基本結構和功能

1.1 APE1/Ref-1的基本結構 APE1基因定位于人第14號染色體長臂11.2-12區，包括4個內含子和5個外顯子。蛋白約由318個氨基酸殘基組成，包含2個不同的功能域，C端區域為DNA修復功能域，賦予APE1脫嘌呤/嘧啶核酸內切酶的活性；N端區域為氧化還原功能域，負責對多個轉錄因子的氧化還原激活功能。APE1的兩個功能域相互獨立，互不影響，大量研究已經證實了以上APE1蛋白功能分布特點[2-3]。

1.2 APE1/Ref-1的基本功能 目前多數研究認為APE1最重要的功能是參與DNA損害的堿基切除修復，是BER途徑的關鍵酶和限速酶，對維持基因組穩定性起著重要作用[3]。內源性或外源性應激產生的ROS可引起多種氧化性DNA損傷，如單鏈斷裂、堿基丟失和堿基修飾，而幾乎全部DNA氧化性損傷由BER途徑修復。在BER途徑中AP位點可以由多個不同的特異性DNA糖基化酶參與發生，但只能由APE1進行修復，所以APE1對DNA損傷修復具有重要意義。如果DNA損傷不能被修復，則這些沒有被修復的AP位點可以阻止DNA正常復制，產生細胞毒作用導致基因變異,擾亂細胞正常增殖和凋亡，啟動癌變的發生[2,4]。APE1的氧化還原功能也非常重要，可以激活多個轉錄因子，對這些轉錄因子進行調控。這些轉錄因子包括AP-1、NFKappaB、CREB、ATF、myb、Pax、HIF-1α、HLF、Egr-1、NF-Y、p53和PEBP2等。APE1維持這些轉錄因子在胞內的還原活性狀態，從而調控細胞周期的增殖和凋亡[5]。APE1的存在對維持細胞生存有著重要作用，APE1缺陷的小鼠胚胎纖維母細胞系無法進行正常傳代繁殖，APE1缺陷可以導致小鼠胚胎早期致死，不能正常發育[6]。但造成這種情況的原因尚有爭議，近來一些研究發現APE1氧化還原活性參與了胚胎造血過程和CD40介導的B細胞分化并由此調節免疫反應，提示在胚胎發育中APE1氧化還原功能也同樣發揮重要作用[7-8]。

2 APE1/Ref-1在腫瘤中的組織分布及與預后的關系

2.1 APE1/Ref-1在正常組織中的表達與分布 研究發現APE1在正常組織細胞中胞內定位有差異性，多數定位于胞核。但近來研究證實在一些高代謝和高生殖率細胞類型，如生殖細胞、淋巴細胞、肝細胞等APE1呈現為胞漿定位。在甲狀腺、骨骼肌、部分胃細胞、腎上腺細胞和腦細胞中表現為胞漿和胞核共同定位[9]。目前認為其復雜的定位方式并不是隨機發生的，其定位有著重要意義，但機制尚不十分清楚。APE1在不同細胞中定位差異的原因可能與其多功能性有關，其修復功能和轉錄功能使我們很容易理解胞核定位意義，但胞核外定位的原因尚不清楚。有研究發現胞漿定位可能是APE1參與了線粒體DNA損傷修復。進一步超微結構和生化分析證明APE1胞漿定位與內質網膜有關，并推測在胞漿中維持核轉錄因子的還原狀態，以便這些轉錄因子進入胞核發揮作用[10]。因此，APE1在胞核外的定位機制尚需進一步研究。此外，有研究證實APE1細胞亞群分布異源性和細胞周期有關，受到細胞內嚴密調控[11]。

2.2 APE1/Ref-1在腫瘤組織中的表達分布及與預后的關系 近年來眾多研究表明APE1基因是一種腫瘤相關基因，在多種惡性腫瘤如肺癌、卵巢癌、宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、胰腺癌中表達增強并伴有胞內定位改變，出現胞漿定位或者胞核/胞漿共同定位，與腫瘤細胞的惡性轉化、浸潤和轉移、放化療抵抗、血管生成、增殖凋亡及預后密切相關。通常表達水平低、胞核定位者預后較好，細胞分化程度較好，腫瘤新生血管較少，較少發生淋巴結及遠隔部位的臟器轉移[3,10,12]。

Yang等[13]發現與正常皮膚和其它皮膚病變（黑痣，發育不良痣）比較，惡性黑色素瘤中APE1表達增高。和正常黑色素細胞比較，不同惡性黑色素瘤細胞系APE1蛋白水平呈倍數增加。在黑痣患者切片中比較黑痣與周邊正常皮膚的APE1表達，前者呈現高表達，提示APE1與黑色素細胞轉化和生長有關。Puglisi等[14]認為乳腺癌患者中APE1胞核胞漿定位改變與預后不良有關，且是不依賴其他主要預后預測因子如組織學分級、淋巴結有無轉移和腫瘤大小的獨立因素。在正常卵巢上皮和非腫瘤疾患中APE1表現為胞核表達，而卵巢癌患者中APE1呈胞漿胞核共表達并表達增高，晚期患者中胞漿表達增高更為明顯，是腫瘤惡性程度高的標志，和預后不良關系密切[15]。在肝癌中，APE1胞漿定位者預后較差，生存期縮短，作者認為在肝癌活檢組織中檢測APE1定位情況對判斷患者預后有價值。在前列腺癌中，APE1胞核染色強度增加，并部分呈現胞漿染色，提示檢測APE1可作為前列腺癌的早期診斷指標[16]。在結腸癌中，APE1呈單獨胞核表達和胞漿、胞核共表達，多因素分析發現APE1的胞漿定位提示患者預后不良[17]。Puglisi等[18]發現在非小細胞肺癌中APE1以胞核表達為主，偶有胞漿表達，表達水平高低與組織學類型無關。但在腺癌和伴有淋巴結轉移的病例中，APE1胞漿表達者預后不佳。Yoo等[19]的研究非小細胞肺癌組織標本發現，在腫瘤部位APE1定位于胞核和胞漿，而在周圍非腫瘤組織APE1定位于胞核。Wang等[20]研究顯示，APE1在骨肉瘤中呈高表達，主要定位于胞核，并與良性骨腫瘤有顯著差異，而且高表達組患者生存期較短，提示APE1與骨肉瘤惡性生物學行為以及腫瘤的分化不良相關，其在骨肉瘤的發生和演進過程中可能起著重要的作用

3 APE1/Ref-1與腫瘤靶向治療

既往研究已證實APE1蛋白水平在很多腫瘤組織中過表達，并有胞內分布的異常改變，部分腫瘤中APE1升高還是預后不佳的標志，可見APE1與腫瘤關系十分密切。APE1表達增高與腫瘤對放化療抵抗有關，所以降低APE1水平可能會調高腫瘤對放化療治療的敏感性，從而提高治愈率，達到控制腫瘤進展和改善患者預后的目的。Zhang等[21]將卵巢癌患者分為順鉑化療有效組和無效組，發現兩組間的APE1表達水平及胞內分布均有不同，順鉑化療有效組APE1表達偏低且多位于胞核，而無效組患者APE1表達較高且胞漿定位者增多。進一步細胞系研究發現APE1高表達的細胞系對順鉑藥物抵抗性增加。同樣其他學者證實在非小細胞肺癌患者中，順鉑化療敏感組APE1蛋白水平表達較低，在肺腺癌細胞系實驗研究中發現順鉑的藥物敏感性與APE1蛋白水平存在劑量依賴性關系。使用腺病毒載體抑制APE1表達后可以提高肺癌細胞對順鉑的藥物敏感性[22]。敲除APE1基因以后骨肉瘤細胞對Co60射線以及MMS等DNA損傷劑敏感性顯著增加[20]。此外，一些其它研究也證實APE1和許多細胞系放化療抵抗有關，通過siRNA技術或反義核苷酸技術靶向降低APE1以后可以誘導腫瘤細胞凋亡，提高腫瘤對放化療的治療敏感性[12,23]。

APE1是涉及放療抗性和烷化劑誘導的細胞毒性的重要DNA修復因子。其DNA修復活性可以修復放射線、烷化劑類化療藥物引起的DNA損傷，通過其磷酸二酯酶活性進行BER修復。不難理解，過表達會對放射線和烷化劑產生抵抗。對其修復活性進行抑制可以提高放化療敏感性。APE1也具有3′-5′的核酸外切酶活性，可以去除DNA脫氧核苷酸的類似物，所以抑制其核酸外切酶活性可以調高化療藥物如吉西他濱的治療效果[24]。Silber等[25]探討了APE1基因表達受抑制時腫瘤細胞對烷化劑的敏感性變化，發現APE1內切酶活性上調增強了腦膠質瘤細胞對烷化劑卡氮芥的抵抗性，同時APE1內切酶活性可被活性氧分子激活。Luo等[26]分析了乳腺癌中抑制APE1內切酶修復活性和乳腺癌細胞對烷化劑敏感性的關系，發現APE1活性下降使乳腺癌細胞對烷化劑的敏感性顯著增加。

隨著APE1基因結構和功能的完全解析，APE1/Ref-1的DNA損傷修復活性可以采用小分子抑制物進行抑制，人為改變APE1的表達水平和修復活性，而后觀察細胞對DNA損傷藥物敏感性的變化。甲氧胺(methoxyamine，MX)，一種 APE1修復活性的間接抑制劑，本身沒有細胞毒性，它可以通過競爭機制和AP位點結合從而阻礙APE1發揮修復作用，實驗研究證實MX和卡氮芥、替莫唑胺聯合應用可以提高這兩個藥物的細胞毒作用[27]。硫蒽酮（lucanthone）同樣可以抑制APE1修復活性，阻斷BER早期修復。硫蒽酮與放療合用治療腦轉移癌患者較單獨放療者，治療后可以使腫瘤體積明顯縮小。在乳腺癌細胞系中硫蒽酮可以提高替莫唑胺的細胞毒作用[26]。因此，使用APE1修復活性靶向抑制劑和傳統治療相結合，可以提高化療有效性。

此外，APE1可以通過其氧化還原依賴途徑和非依賴途徑，介導多個轉錄因子（如AP-1，NF-B，p53）的轉錄調控，進而調控細胞生存、增殖和凋亡。近來越來越多研究表明氧化還原功能對細胞增殖也很重要。一項研究證實小分子抑制物E3330可以特異性抑制APE1氧化還原功能，在體外可以抑制卵巢癌細胞和小鼠視網膜血管內皮細胞的增殖[28]。這說明APE1的兩個功能都很重要，到底是哪一個功能起到關鍵作用還不明確，可能在不同的細胞有著不同的作用。這需要發現新的特異性抑制藥物來進一步研究證實。

4 展望

APE1基因進一步需要在不同的腫瘤進行更多的基礎和臨床實驗研究，可以作為臨床早期診斷和評價治療效果的潛在標志物，可以提高腫瘤放化療敏感性，可能會成為多個腫瘤治療的新的靶點，在臨床應用方面有廣泛的前景。

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