人骨髓間充質干細胞體外培養模型的建立和表型分析

劉長樂 ，李廣平 ，鄭心田 ，孟恒星 ，邱錄貴 ，婁建石

（1.天津醫科大學第二醫院心臟科，天津300211；2.中國協和醫科大學血液病學研究所，天津300020；3.天津醫科大學藥理學教研室，天津300070）

骨髓（bonemarrow，BM）中包含有兩類干細胞，即造血干細胞和間充質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs屬混雜細胞群，其表面抗原標志尚未完全確定。MSCs作為多能干細胞具有可塑性，有報道顯示在細胞因子作用下可以在體外誘導分化為骨骼肌細胞、脂肪細胞、心肌細胞、上皮細胞和血管內皮細胞，并且參與體內組織新生、損傷修復和重建[1]。本實驗應用改進的密度梯度離心法、差異貼壁法和酶消化法建立MSCs的體外培養擴增模型，尋找高度特異性的表面抗原，以利于干細胞移植的廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）BM：39歲男性健康志愿者5mL。（2）儀器：FACScar流式細胞儀（Beckman-Coulter），倒置相差顯微鏡（OLYMPUS），熒光顯微鏡（OLYMPUS），恒溫培養箱（Forma Scientific），高速低溫離心機（Beckman-Coulter），細胞計數儀 KX21型（SYSMEX）。（3）試劑和材料：人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品公司）、DMEM/F12+MCDB培養基（Invitrogen），FCS（hyclon），IGF（pepro tech），bFGF（pepro tech），EGF （pepro tech），CD34 IgG（Coulter），KDR IgG （R&D Systems），CD44 FITC（Genevale），CD45 FITC（Coulter），CD54 FITC（B&D），CD73 PE（B&D），CD90 FITC （B&D），CD105 PE（Laboratories），CD106 PE（Biole gend），IgG-FITC/PE（B&D）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的原代培養 抽取BM液5mL，肝素抗凝。DMEM+F12培養液稀釋后，用人淋巴細胞分離液Ficoll（比重為1.077）密度梯度離心法，分離出單個核細胞。用DMEM+F12洗滌后，加入DMEM+F12與MCBD的混合培養液，并加入10%胎牛血清（FCS）、2 ng/mL bFGF、10 ng/mLEGF、10 ng/mL IGF。24 h后棄去未貼壁細胞，貼壁細胞繼續培養，每4d半量換液，倒置相差顯微鏡每天觀察生長情況，蘇木-伊紅（HE）染色觀察攝片。

1.2.2 MSCs的傳代培養 生長12 d后近融合時，用2mL 0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液消化，以1:2～1:3傳代。每天觀察生長情況。

1.2.3 表面抗原檢測 收集培養細胞，取1×104個細胞用PBS調整到100μL，經多聚甲醛固定后用流式細胞分析儀檢測 CD34、CD45、CD54、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和KDR陽性表達百分比。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下直接觀察細胞形態 從BM液中分離出的單個核細胞培養24 h后，可見散在貼壁細胞，并伸展為長梭形或多角形，即為原代MSCs（P0）。細胞呈克隆樣成簇生長，初始細胞形態及大小不一。原代MSCs培養14 d，克隆生長細胞見有90%融合。第4代細胞形態漸趨均一化，生長速度快且倍增穩定。見圖1、2。

2.2 HE染色 胞核呈藍色、卵圓形，大而不規則，可見核仁，胞漿呈粉紅色，胞質均勻，胞膜較清楚。見圖3。

圖3 MSCs（HE，×400）

2.3 MSCs表面抗原表達 流式細胞儀檢測結果顯示:CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-、KDR-。具體數值見圖 4。

圖4 MSCs表面抗原表達（%）

3 討論

目前研究MSCs的生物學特性和增殖特點的關鍵是利用一種方法獲得更為純凈、單一的MSCs。密度梯度離心是目前應用最多的方法，本實驗結合自然貼壁法、酶消化法分離獲得的細胞較多，而且增殖速度較快。BM單個核細胞接種24 h后有少量細胞貼壁，貼壁后分裂增殖逐漸伸展成梭形或多角形，貼壁第5天呈克隆樣簇狀生長，細胞數量擴增，生長速度加快。經傳代培養擴增至第4代，細胞形態較為均一，生長倍增穩定。

目前鑒定MSCs的表面標記物具有非專一性和種屬特異性，MSCs可以表達間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志，以及多種細胞因子、粘附分子和生長因子的受體[1]。人MSCs與造血干細胞共同存在于BM中，但MSCs不表達典型造血細胞表面抗原，如造血干細胞標志抗原CD34、白細胞標志抗原CD45、單核/巨噬細胞表面抗原CD14等[2]。MSCs只表達 CD29、CD44、CD90、CD105、CD166 等基質細胞和間質細胞的特異性表面標志[3]。還有報道 CD105+、CD73+、CD90+和 CD45-、CD34-、CD14-這一細胞群代表MSCs[4]。

本實驗中CD34在MSCs中表達量極小，說明不表達造血細胞的表面標志。CD45是泛白細胞標志物，又稱白細胞共同抗原，有研究報道在用單克隆抗體磁珠分選MSCs組分時，發現CD45在MSCs有低水平的表達，但在人工培養下，很快即失去表達陽性[4]。本實驗第4代MSCs顯示CD45為陰性表達，與文獻報道一致。血管內皮細胞生長因子受體2（kinase-insert domain contein ing receptor，KDR），主要表達在血管內皮細胞及胚胎內皮的前體細胞上。目前多數BM來源的內皮前體細胞具有某些血管內皮細胞表型，稱之為內皮祖細胞。在本實驗中，KDR在MSCs有微量表達，這些KDR+細胞亦可能是內皮祖細胞群，反映了MSCs與血管內皮細胞可能有一定的近緣關系[5]。CD106即血管細胞黏附分子（VCAM-1），可以表達于BM基質細胞，本實驗MSCs中CD106弱陽性表達細胞占24.85%，顯示出BM基質細胞的相關表型。CD54稱為細胞間粘附分子-1(ICAM-1)，在人體內表達較局限，僅限于T、B淋巴細胞、單核細胞，某些上皮細胞、內皮細胞等。本實驗MSCs呈中等量表達CD54，表明MSCs保留BM單核細胞的某些特性。CD44為一種粘附分子，是骨橋蛋白和透明質酸的受體，在BM的組成中起著重要作用，本實驗CD44在MSCs表達呈強陽性也證實了其表型特異性[6]。CD105，又稱轉化生長因子-β，在BM前體細胞和單核細胞中表達，是構成細胞膜整體所必需的蛋白質。CD73存在于淋巴細胞B和T細胞亞群、濾泡樹突細胞、上皮細胞等，可能是淋巴細胞的成熟標志。CD90同時表達于腦和淋巴組織。本實驗此三種抗原均呈強陽性表達，與先前文獻有一定差異，是一個值得注意的現象。我們認為 MSCs表型呈現：CD44++、CD73++、CD90++、CD105++；CD54+、CD106+、CD34-、CD45-的特征，表明各抗原表達差異明顯，具有一定程度特異性，也證明所獲取的MSCs純度較高。

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