球莖甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)和植株再生研究

王超楠，聞鳳英，劉曉暉，羅智敏，趙冰，黃志銀

（天津科潤蔬菜研究所，天津，300384）

球莖甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)和植株再生研究

王超楠，聞鳳英，劉曉暉，羅智敏，趙冰，黃志銀

（天津科潤蔬菜研究所，天津，300384）

以10個球莖甘藍(lán)品種（系）為試材，采用游離小孢子培養(yǎng)方法，研究胚狀體發(fā)生及其再生植株獲得方法。研究結(jié)果表明，添加適量6-BA不僅使胚誘導(dǎo)成功率達(dá)到了100%，還顯著提高了出胚率；胚狀體發(fā)育程度和整齊度與基因型及每皿出胚數(shù)有關(guān)；子葉期為最佳的轉(zhuǎn)接時期；MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA是最適的成苗培養(yǎng)基。

球莖甘藍(lán)；小孢子培養(yǎng)；胚狀體；植株再生

球莖甘藍(lán) （Brassica oleraceaL.var.caulorapaDC.）又名苤藍(lán)，營養(yǎng)豐富，是制作腌菜的重要原料，近年來鮮食用量呈上升趨勢。但目前國內(nèi)主要栽培種為常規(guī)種，種性退化嚴(yán)重，無法與國外的優(yōu)質(zhì)品種競爭，所以選育具有自主知識產(chǎn)權(quán)的球莖甘藍(lán)雜交新品種是亟待解決的問題。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行親本純化，可以快速獲得親本材料，縮短新品種選育年限。自Lichter[1]首次報道獲得甘藍(lán)型油菜小孢子胚及再生植株以來，很多學(xué)者對十字花科蔬菜小孢子培養(yǎng)過程中的影響因素進(jìn)行了研究[2～4]，但迄今為止，國內(nèi)還未見球莖甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)植株再生的相關(guān)報道，試驗以10個球莖甘藍(lán)品種（系）為試材，對影響胚誘導(dǎo)和植株再生的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，并獲得了大量胚狀體和再生植株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為10個球莖甘藍(lán)品種（系）：川島脆、河?xùn)|大苤藍(lán)、東川苤藍(lán)、天津青苤藍(lán)、大青皮芋頭、玉冠、早冠、天津白苤藍(lán)、H和P3。2008年8月中旬播種于穴盤育苗，9月初定植到冷棚中，11月下旬移入陽畦越冬，2009年1月中旬移栽至溫室，花期取材培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

花期選取長2.5～4.5 mm的花蕾分離小孢子，分離純化和懸浮培養(yǎng)過程參照栗根義等[5]和姜鳳英等[6]采用的方法，稍有改良。

①分別在A：1/2 NLN-13；B：1/2 NLN-13+0.2 mg/L 6-BA；C：1/2 NLN-13+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 3種培養(yǎng)基上對10個試材進(jìn)行培養(yǎng)，分析植物生長調(diào)節(jié)劑對胚誘導(dǎo)的影響。

②以川島脆、H、P3、天津白苤藍(lán)為試材，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，分析基因型對胚狀體發(fā)育的影響。

③以川島脆、P3為試材，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，分析每皿胚數(shù)對胚狀體發(fā)育的影響。

④以H各發(fā)育時期的胚狀體為試材，分別接種于MS＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂培養(yǎng)基上，置于25℃，光照12 h/d，光強(qiáng)6 000 lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。分析胚狀體發(fā)育狀態(tài)對胚成活的影響。

⑤以H的子葉形胚為試材，接種于添加不同濃度6-BA和NAA的MS＋3%蔗糖＋0.8%瓊脂培養(yǎng)基上，6-BA設(shè) 0.2，0.5，1 mg/L 3個濃度，NAA設(shè)0.05，0.1 mg/L 2個濃度，空白處理為對照，總共6個處理，分析植物生長調(diào)節(jié)劑對胚成活及萌芽的影響。

成活率（%）=（成活胚數(shù)/接種胚數(shù)）×100%

不定芽誘導(dǎo)率 （%）=（萌發(fā)不定芽胚數(shù)/成活胚數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑對小孢子胚誘導(dǎo)的影響

由表1可知，在1/2 NLN-13基本培養(yǎng)基上，10個基因型中有5個誘導(dǎo)得到胚狀體，誘導(dǎo)成功率為50%，添加0.2 mg/L 6-BA后10個基因型均誘導(dǎo)出胚，誘導(dǎo)成功率達(dá)到100%，且出胚率顯著提高，但再加入NAA后，幾乎所有品種出胚率都顯著下降，說明6-BA對胚誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用，而NAA多數(shù)情況下為抑制作用。川島脆苤藍(lán)出胚率不加植物生長調(diào)節(jié)劑時最高，添加植物生長調(diào)節(jié)劑后反而大幅降低，說明植物生長調(diào)節(jié)劑在誘導(dǎo)中起到了重要的作用，能夠擴(kuò)大基因型反應(yīng)范圍，但不同基因型的反應(yīng)不同。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對球莖甘藍(lán)小孢子胚誘導(dǎo)的影響

表2 基因型對球莖甘藍(lán)小孢子胚發(fā)育的影響

表3 每皿胚數(shù)對球莖甘藍(lán)小孢子胚發(fā)育的影響

表4 胚狀體發(fā)育時期對胚成活的影響

2.2 基因型對胚狀體發(fā)育的影響

本試驗中獲得的胚狀體有的能夠發(fā)育成子葉形，有的則停留在魚雷形、心形甚至球形不再發(fā)育，而且胚狀體發(fā)育具有不同步性，往往同一皿中會出現(xiàn)幾種發(fā)育階段胚狀體并存的情況。從表2可以看出，川島脆的胚狀體發(fā)育程度最高，整齊度也一致，子葉形胚比例達(dá)到了68.9%，顯著高于H，P3和天津白苤藍(lán)。天津白苤藍(lán)的發(fā)育程度最差，只有3.33%的子葉形胚，大多數(shù)為處于發(fā)育初級階段的球形胚和心形胚，說明基因型是影響胚狀體發(fā)育的重要因素，不同基因型誘導(dǎo)得到的胚狀體發(fā)育程度和整齊度存在顯著差異。

2.3 每皿胚數(shù)對胚狀體發(fā)育的影響

觀察發(fā)現(xiàn)胚狀體發(fā)育程度和整齊度還與每皿胚數(shù)有關(guān)。從表3可知，當(dāng)川島脆每皿胚數(shù)低于60個時，子葉形胚比例可達(dá)80%；而當(dāng)每皿胚數(shù)高于100個時，子葉形胚比例明顯下降，只有24.44%。同樣當(dāng)每皿胚數(shù)高于100個時，P3的子葉形胚比例也明顯下降，由34.44%下降到了8.89%。說明除了基因型的影響外每皿胚數(shù)也對胚狀體發(fā)育有很大的影響，每皿中胚數(shù)量過多不利于胚狀體的發(fā)育。

2.4 胚狀體發(fā)育時期對胚成活的影響

由表4可以看出，胚成活率與胚狀體發(fā)育時期關(guān)系密切，發(fā)育成熟的胚狀體成活率遠(yuǎn)高于發(fā)育不完全的胚。子葉形胚成活率為83.33%；魚雷形胚成活率為 43.33%；心形胚和球形胚成活率僅為18.89%；畸形胚不再繼續(xù)發(fā)育，成活率為0?？梢娕郀铙w成熟度較高時，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上較容易成活，所以子葉形胚為轉(zhuǎn)接的最佳時期。這與姜鳳英等[7]在羽衣甘藍(lán)上的結(jié)論一致。

2.5 植物生長調(diào)節(jié)劑對胚成活及萌芽的影響

培養(yǎng)基中添加不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，對胚狀體成活和不定芽誘導(dǎo)都有影響。表5顯示，添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時胚狀體成活率最高，達(dá)到86.67%，此時的不定芽誘導(dǎo)率也最高，為42.31%；其次是0.5 mg/L 6-BA＋0.05 mg/L NAA的組合；不添加植物生長調(diào)節(jié)劑時雖然也能獲得較高的胚狀體成活率，但是不能誘導(dǎo)分化出不定芽，不利于進(jìn)一步成苗；植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過高時又會導(dǎo)致胚狀體成活率和不定芽誘導(dǎo)率下降。所以添加適宜濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，既有利于提高胚狀體成活率，又能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽。

2.6 再生植株的獲得

將誘導(dǎo)得到的不定芽經(jīng)過幾次繼代后得到健壯試管苗，在MS+0.1 mg/L NAA的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根，2周后就能長出根系形成完整植株。經(jīng)煉苗后，將帶有根系的試管苗移栽至營養(yǎng)缽中，前期覆蓋塑料薄膜保濕，2周后即可成活。

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑對球莖甘藍(lán)小孢子胚成活及萌芽的影響

3 小結(jié)與討論

馮輝等[8]報道，在菜用羽衣甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中，適宜濃度的6-BA與NAA配合使用顯著提高了胚狀體誘導(dǎo)率。在本試驗條件下發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的6-BA不但能夠擴(kuò)大球莖甘藍(lán)的出胚基因型范圍，使成功率由50%提高到100%，還顯著提高了出胚率，特別是對在未添加植物生長調(diào)節(jié)劑時不能出胚或出胚率較低的基因型作用更明顯。但在同時添加6-BA和NAA時，胚誘導(dǎo)率卻比單獨(dú)添加6-BA時有所下降，與前人的結(jié)論不同，可能是由于選用的試材不同造成的，也可能是因為本試驗中所設(shè)濃度處理較少，所以要獲得每種基因型的最適濃度配比，需要設(shè)計多處理試驗。

本試驗表明，基因型和每皿出胚數(shù)都對胚狀體發(fā)育有顯著的影響。每皿出胚數(shù)較少時，胚狀體發(fā)育整齊度和成熟度都較高，隨著出胚數(shù)的增加，球形胚和心形胚比例升高，子葉形胚比例明顯下降。這可能是由于當(dāng)每皿中胚狀體數(shù)量過多時，造成營養(yǎng)不足，導(dǎo)致胚狀體發(fā)育受到影響。此外試驗中觀察到，當(dāng)發(fā)現(xiàn)出胚較多時及時向培養(yǎng)皿中添加新鮮培養(yǎng)基或先將較大的胚轉(zhuǎn)出均有助于胚狀體的進(jìn)一步發(fā)育。

在MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA有利于提高胚狀體成活率和不定芽誘導(dǎo)率，盡早誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽可以減少繼代次數(shù)，加快成苗速度，而且分化出的大量不定芽還有利于再生植株的擴(kuò)繁。

[1]Lichter R.Induction of haploid plants from isolated pollen ofBrassica napus.[J].Z.pflanzenphysiol,1982,105:427-434.

[2]Sato T,Noshio T,Hirai M.Plant regeneration from isolated microspore culture of Chinese cabbage(Brassica campestris ssp．pekinensis)[J]．Plant Cell Reports,1989,8:486-488.

[3]方淑桂，陸文輝，曾小玲，等．結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生[J]．園藝學(xué)報，2006，31（1）：158-160.

[4]耿建峰，侯喜林，張曉偉，等．影響白菜游離小孢子培養(yǎng)關(guān)鍵因素分析[J]．園藝學(xué)報，2007，34（1）：111-116．

[5]栗根義，高睦槍，趙秀山.大白菜游離小孢子培養(yǎng)[J]．園藝學(xué)報，1993，20（2）：167-170.

[6]姜鳳英，馮輝，王超楠.羽衣甘藍(lán)的小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生[J]．植物生理學(xué)通訊，2005，41（6）：725-727.

[7]姜鳳英，馮輝，王超楠，等.幾種影響羽衣甘藍(lán)小孢子胚狀體成苗的因素[J].植物生理學(xué)通訊，2006，42（1）：58-60.

[8]馮輝，郭姝，馮建云，等.菜用羽衣甘藍(lán)的小孢子胚誘導(dǎo)和植株再生[J].園藝學(xué)報，2009，36（4）：587-592

Research on Embryogenesis and Plant Regeneration from Isolated Microspore Culture of Kohlrabi

WANG Chaonan,WEN Fengying,LIU Xiaohui,LUO Zhimin,ZHAO Bing,HUANG Zhiyin
(Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,Tianjin 300384)

Isolated microspore culture was carried out by ten cultivar(strains)of Kohlrabi.It was found that adding suitable concentration of 6-BA could not only raise the embryo induction success to 100%,but also improve inducing rate remarkably.Genotypes and the number of embryos per dish had some effect on development of embryos.Cotyledon period is the optimal stage to transfer to plantlet regeneration medium."MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA"was the optimal plantlet regeneration medium.

Kohlrabi;Microspore culture;Embryo;Plant regeneration

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.02.004

天津市科技支撐計劃重點(diǎn)項目（08ZCKFNC01900），天津市自然科學(xué)基金項目（10JCYBJC08700），天津市農(nóng)科院院長基金項目（08008）

王超楠，女，碩士，助理研究員，主要從事十字花科蔬菜育種，E-mail：chaonan229@163.com

2010-08-13