光暗交替及全黑暗對水杉種子萌發過程中同工酶的影響

景丹龍，王玉兵，梁宏偉，王靜，張德春

（1.三峽大學生物技術研究中心，湖北 宜昌 443002；2.神農架國家級自然保護區管理局生物多樣性保護研究實驗室，湖北 木魚 442400）

水杉（Metasequoia glyptostroboides）屬杉科水杉屬，落葉喬木，素有“活化石”之稱，是世界上珍稀的孑遺植物。主要分布在湖北、四川、湖南三省交界的利川、石柱、龍山等局限地區。水杉樹形優美，生長快，是亞熱帶地區平原綠化的優良樹種，也是速生用材樹種；在古植物學、古氣候學、古地理和地質學，以及裸子植物系統發育的研究中均有重要意義[1]。

同工酶是生物體內的結構及理化性質不同而能催化同一反應的酶，廣泛應用于生物進化、遺傳學、生理學等研究。作為遺傳基因的標記植物，它對植物的生理生化及新陳代謝方面的研究具有重要意義。目前，對水杉的研究主要集中在其地理分布、系統演化地位、群落生態學以及遺傳多樣性等方面[2-3]，由于水杉種子天然發芽率低，種子向幼苗的轉型率低，自然更新困難，加上人為破壞等原因，致使野生水杉數量急劇下降而處于瀕危狀態[4]。筆者針對水杉種子萌發困難的突出問題，通過對水杉種子在光暗交替與全黑暗下萌發過程中的同工酶進行分析，旨在探索水杉種子萌發的分子機理，進而為挽救瀕危植物水杉提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水杉種子采自2010年10月湖北省利川。在水杉種子發芽率試驗中，分別取光暗交替（光照12 h/d）和全黑暗條件下，發芽過程中不同萌發時間（1～6 d）的水杉種子，每天取樣1次，每次5份，每份0.5 g，液氮處理后，放入-70℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶液制備酶液的提取:分別取-70℃下保存的材料0.5 g，加入PVP 0.1 g，磷酸緩沖液2.5 mL（pH值為7.8，使用時需預冷），冰浴研磨成勻漿，12000 r/min，4℃離心20 min，取上清液，離心3次，即為酶提取液，用于同工酶分析。

1.2.2 電泳和染色同工酶電泳采用不連續垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠制備參照何忠效等[5]的方法。分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為3%，膠厚1.5 mm，每槽加樣40 U（酶提取液∶40%甘油∶10%溴酚藍=30∶10∶1），電極緩沖液為Tris-甘氨酸溶液（pH值為8.3），初始電流強度為20 mA，后增加至30 mA；4℃下，電泳4～5 h后，進行酯酶（EST）、淀粉酶（AMY）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、ATP酶（ATPase）同工酶等5種同工酶的染色。

EST同工酶采用醋酸萘酯-堅牢藍RR鹽染色法[6]；AMY同工酶采用淀粉-醋酸-碘染色法[5]；SOD同工酶參照何忠效等[5]介紹的NBT光還原法；POD同工酶采用醋酸-聯苯胺染色方法[5]；ATPase同工酶采用Tris-甘氨酸緩沖-ATP-氯化鈣染色法[7]。

2 結果與分析

2.1 水杉種子萌發過程中的酯酶（EST）同工酶酶譜的變化

從圖1可知，電泳的負極到正極依次為A1～A13，共13條酶帶。其中，A1、A2是各時期的共有酶帶。水杉種子在光暗交替條件下萌發時，第3天的EST同工酶酶帶數明顯增多，第4天達到最多；而黑暗條件下萌發的種子酶帶數在第4天才開始增多，第6天達到最多。從整體看，光暗交替條件進行萌發的水杉種子的酶帶數和含量要明顯優于全黑暗。

圖1 水杉種子不同光照條件萌發過程中EST電泳圖譜

2.2 水杉種子萌發過程中的過氧化物酶（POD）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發過程中的過氧化物酶（POD）同工酶酶譜變化如圖2所示，共有5條酶帶，從負極到正極依次為A1～A5，其中A1、A2、A3、A5是各時期的共有酶帶。A4在光暗交替條件下第3天出現，接著消失，第6天又重新出現；而A4在全黑暗條件下第4天才出現，消失后第6天又重新出現。由于A4在兩種萌發條件下的表達差異明顯，所以A4是調控水杉種子萌發的非常重要的酶。

圖2 水杉種子不同光照條件萌發過程中POD電泳圖譜

2.3 水杉種子萌發過程中的淀粉酶（AMY）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發過程中的淀粉酶（AMY）同工酶酶譜的變化如圖3所示，從負極到正極依次為A1-A3，一共3條酶帶，其中A1、A3是其各時期的共有酶帶，A2在光暗交替條件下第2天出現，而在黑暗條件下第1天出現。但從圖中可以看出，水杉種子在光暗交替條件下的AMY同工酶含量高于黑暗條件下，說明光暗交替條件下的水杉種子能在萌發過程中提供更多的能量。

圖3 水杉種子不同光照條件萌發過程中AMY電泳圖譜

2.4 水杉種子萌發過程中的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發過程中的超氧化物歧化酶（SOD）同工酶酶譜的變化如圖4所示，從負極到正極依次為A1～A4，一共4條酶帶，其中A1、A4為各時期的共有酶帶。水杉種子在光暗交替條件下，A2在第1天出現，A3在第3天出現，而在黑暗條件下，A2在第3天出現，A3在5天出現。這說明光暗交替條件下的水杉種子在清除有害代謝產物方面優于全黑暗條件下。

圖4 水杉種子不同光照條件萌發過程中SOD電泳圖譜

2.5 水杉種子萌發過程中的ATP酶（ATPase）同工酶酶譜的變化

水杉種子萌發過程中的ATP酶同工酶酶譜的變化如圖5所示，一共6條，從負極到正極依次為A1～A6，其中A1、A2、A3、A4為各時期的共有酶帶。A5、A6在光暗交替條件下第1天出現，而在全黑暗條件下第5天出現。從整體看，光暗交替條件進行萌發的水杉種子各時期ATPase同工酶含量要明顯優于全黑暗所對應的各時期。

圖5 水杉種子不同光照條件萌發過程中ATP電泳圖譜

3 討論

光照是植物生長發育過程中不可缺少的環境因子。本試驗的結果表明，光暗交替條件下進行萌發的水杉種子的EST、AMY、SOD、POD、ATPase同工酶明顯優于全黑暗條件下萌發的水杉種子。種子發芽能力直接影響了植物在森林演替中的地位，一般認為光照強度是先鋒植物種類在林下發展的主要限制因子。朱小龍等[8]在研究光照條件對長苞鐵杉種子萌發影響時，也發現50%全日照條件下，種子萌發率和幼苗存活率最高。

SOD和POD為細胞氧化還原系統的組成酶，能通過有效地清除細胞內過量的活性氧、自由基，維持胞內活性氧水平的平衡[9]。水杉種子在光暗交替條件下的SOD和POD同工酶含量明顯高于全黑暗條件下，說明水杉種子在光暗交替條件下，能夠及時清除細胞代謝過程中產生的自由氧基和有害物質，從而減少活性氧對植物體的危害，更利于水杉種子的萌發。AMY和ATPase同工酶能為細胞代謝活動及時提供能量[10-11]，而本試驗中光暗交替條件下水杉種子的AMY和ATPase同工酶含量也明顯高于全黑暗處理的種子。

從同工酶水平分析可知，光暗交替條件比全黑暗條件更利于水杉種子的萌發。由于自然條件下，水杉種子的空癟率較高，萌發率較低，因此如何更好的結合其他因素提高水杉種子的萌發率，成為下階段的研究重點之一。

[1]傅立國,金鑒明.中國植物紅皮書:稀有瀕危植物（第1冊）[M].北京:科學出版社，1992.568-569.

[2]李春香,楊群,周建平.水杉自然居群遺傳多樣性的PAPD研究[J].中山大學學報,1999,38（l）:59-63.

[3]李建華,班繼德.中國特產的水杉群落[J].河南師范大學學報（自然科學版），1989,（4）:49-54.

[4]熊彪,姚蘭,易詠梅,等.水杉原生母樹生長勢調查研究[J].湖北民族學院學報（自然科學版）,2009,27（4）:339-442.

[5]何忠效,張樹政.電泳[M].北京:科學出版社,1999.37-38,286-300.

[6]湯章城.現代植物生理學實驗指南[M].北京:科學出版社,1999.264-266.

[7]胡能書,萬賢國.同工酶技術及其應用[M].長沙:湖南科學技術出版社,1985.77-80.

[8]朱小龍,宋愛琴,王建林,等.光照條件對長苞鐵杉種子萌發與幼苗生長的影響[J].福建林學院學報,2008,28（3）:262-266.

[9]王長義,郭世榮,劉超杰.鈣對根際低氧脅迫下黃瓜幼苗根系保護酶同工酶表達的影響[J].西北植物學報,2009,29（9）:1874-1880.

[10]杜景川,景丹龍,陳發菊,等.瀕危植物香果樹愈傷組織經長期繼代后的6種同工酶研究[J].安徽農業科學,2010,38（19）:10010-10014.

[11]王華東,唐紅.民勤旱生灌木河西沙拐棗的酯酶同工酶分析[J].廣東農業科學,2009,（11）:162-164.