莖瘤芥（榨菜）黑斑病病原菌生物學特性

劉紅芳

（長江師范學院，重慶 涪陵 408100）

莖瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）是重慶市的特色農業資源，其加工產品“涪陵榨菜”蜚聲海內外。在主產區涪陵，每年莖瘤芥種植面積約4萬公頃，是該區農民增收的主要經濟來源。危害莖瘤芥的病害主要有病毒病、根腫病、霜霉病和黑斑病等，這些病害嚴重影響榨菜生產的順利進行，成為該產業發展的一大障礙。王旭祎等對病毒病、根腫病、霜霉病的發生、防治進行了相關研究[1-2]。但對莖瘤芥黑斑病的研究，至今未見相關報道。自2010年始,筆者對莖瘤芥黑斑病進行了病原菌生物學特性研究，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌種來源

從重慶市涪陵區農科所采集莖瘤芥黑斑病標本,在PDA培養基上用常規組織分離法獲得純培養后,再按柯赫氏法則接種進行致病性測定,對再次分離得到的病原菌據《中國真菌志——鏈格孢屬》進行鑒定[2]。

1.2 莖瘤芥黑斑病菌生物學特性的研究

1.2.1 培養基對菌絲生長的影響選用PDA、PSA、玉米粉培養基、燕麥片培養基和Czapek培養基等5種培養基。取PDA上培養的菌種，分別放于5種培養基平板中央，25℃恒溫培養，4次重復，直至生長最快的培養基中菌落直徑接近9 cm時，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑。

1.2.2 營養生長及孢子形成（1）溫度。PDA培養基接菌后分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃培養箱中，每處理4次重復，直至生長最快的溫度設置處理中菌落直徑接近9 cm時，用十字交叉法測量菌落直徑。培養10 d后，用直徑7 mm的打孔器在距菌塊中心1 cm處打取菌餅，置于10 mL無菌水中激烈振蕩制成孢子懸浮液,滴4～6滴于載玻片上，在顯微鏡下鏡檢,每滴記5～8個視野內的孢子數，取其平均值（各處理隨機抽取，1次重復）。以下各項實驗控制溫度為25℃，生長最快的處理中菌落直徑接近9 cm時，用十字交叉法測量菌落直徑，培養10 d后測產孢量（未標明處均為3次重復）。（2）pH值。用磷酸緩沖液將PDA培養基pH值調配為3、4、5、6、7、8、9、10、11。（3）光照。將接種后的PDA培養基分別置于日光燈下連續光照、12 h光暗交替、連續黑暗等條件下。（4）碳源利用。在Czapek培養基中分別以等量的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露糖、木糖等與其中的蔗糖（CK）置換。（5）氮源利用。在Czapek培養基中分別以等量的硝酸鉀、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氯化銨和硫酸銨等6種氮源與其中的NaNO3（CK）置換。

1.2.3 孢子萌發（1）溫度。配制孢子懸浮液，分置于5、10、15、20、25、30、35、40℃培養箱中，于4、8、12、24 h鏡檢孢子萌發率。以下各條件實驗控制溫度為25℃，24 h后鏡檢孢子萌發率（未標明處均為3次重復）。。（2）pH值。用磷酸緩沖液將孢子懸浮液pH值調配為3、4、5、6、7、8、9、10、11，每處理重復6次。（3）營養。設莖瘤芥浸漬液、1%葡萄糖液、無菌水等3個處理。（4）濕度。用濃硫酸在密閉的干燥器中調節濕度，自菌落上挑取少許孢子在載玻片上涂勻，將相對濕度控制在100%、98%、93%、90%、80%、75%、65%、50%。（5）光照。將孢子懸浮液滴一滴于載玻片上，分置于日光燈下連續光照、12 h光暗交替、連續黑暗等條件下。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定

對病葉進行組織分離培養后,將菌株回接到幼嫩的莖瘤芥（榨菜）葉上，均能產生典型的莖瘤芥（榨菜）黑斑病病斑，再次進行分離，挑取單孢純化，獲得病原菌。將分離、純化得到的菌株在顯微鏡下觀察,結果表明，病原菌菌株分生孢子梗單生或數根束生，暗褐色；分生孢子褐色或青褐色，圓筒形至橢圓形,具一短喙，3～6個串生，有縱隔膜0～4個，橫隔膜3～8個，橫隔處有縊縮現象。根據真菌分類鑒定，此病原菌為鏈格孢菌[3]。

2.2 莖瘤芥黑斑病菌生物學特性的研究

2.2.1 培養基對菌絲生長的影響在5種不同培養基上，病原菌均能生長，但在PDA和PSA培養基上菌落生長最好，其次為玉米粉、燕麥片和Czapek培養基（圖1）。

圖1 第五天時五種培養基菌落生長直徑

2.2.2 營養生長及孢子形成（1）溫度。不同溫度下，病原菌的生長有極顯著的差異。病原菌在25～30℃生長最快，為最適生長溫度，25℃最適產孢，低于5℃或高于40℃，菌絲均不能生長（表1）。（2）pH值。病原菌在pH值3～11范圍內均可生長，pH值6～8時生長較好，pH值5～7時適宜產孢，以pH值6最適（表2）。（3）光照。不同光照處理對菌絲的生長無顯著影響，但在全光照處理下產孢量最多，其次是光暗交替處理；全黑暗處理產孢量最少，表明光照具有促進病原菌產孢的作用（表3）。（4）碳源利用。在不同碳源中，菌絲生長速度存在明顯差異，以麥芽糖最為理想，其次為葡萄糖，木糖最差。在供試的碳源中，病原菌均可產孢，其中以麥芽糖最適，其次為葡萄糖，甘露糖最差（表4）。（5）氮源利用。病原菌對牛肉膏、蛋白胨和酵母膏的利用效果最好，其次為硝酸鉀和硝酸鈉，氯化銨和硫酸銨的利用最差。在供試的氮源中病原菌均可產孢，其中以牛肉膏、蛋白胨最適，其次為酵母膏，氯化銨最差。這說明病原菌對有機態氮和硝態氮利用效果好（表5）。

表1 不同溫度對病原菌生長及產孢的影響

表2 不同PH值對病原菌生長及產孢的影響

表3 光照對病原菌生長及產孢的影響

表4 不同碳源對病原菌生長及產孢的影響

表5 不同氮源對病原菌生長及產孢的影響

2.2.3 孢子萌發（1）溫度。溫度對病原菌分生孢子的萌發率有較大影響。病原菌在10～35℃均能萌發，20～30℃是萌發的適宜溫度區，低于10℃則分生孢子的萌發受到抑制，40℃條件下未見萌發（圖2）。（2）pH值。分生孢子在pH值3～11時均能萌發,在pH值6～7時24 h萌發率達到80%以上,其余均不足50%。pH值為3和11時，萌發率較低，24 h僅30%萌發（圖3）。（3）營養。分生孢子在莖瘤芥葉片浸漬液、1%葡萄糖液和無菌水中均能萌發。在莖瘤芥葉片浸漬液和1%葡萄糖液中萌發率均高于無菌水中的萌發率，但分生孢子的萌發率差別不大（圖4）。（4）濕度。分生孢子萌發對相對濕度的要求非常嚴格，RH在90%以上時孢子才能萌發，最適RH為98%～100%，當RH<90%時，孢子不能萌發，當RH為100%時，萌發率達到最大值97%（圖5）。（5）光照。通過全光照、12 h光照12 h黑暗和無光照的培養,結果表明:全光照處理孢子萌發率最高,達95.6%；其次是光暗交替處理，孢子萌發率為93.8%；全黑暗處理孢子萌發率為89.7%，明顯低于前兩者。這表明光照具有促進病原菌分生孢子萌發的作用（圖6）。

圖2 溫度對病原菌分生孢子萌發的影響

圖3 pH值對病原菌分生孢子萌發的影響

圖4 營養對病原菌分生孢子萌發的影響

圖5 濕度對對病原菌分生孢子萌發的影響

圖6 光照對病原菌分生孢子萌發的影響

3 小結

鏈格孢菌為一類寄主范圍較廣的病原菌,人們對該類病原菌的生物學特性研究的較多[4-6]。本文針對莖瘤芥（榨菜）黑斑病病原菌的生物學特性進行了研究，確定該病原菌最適生長培養基為PDA培養基和PSA培養基；最適生長溫度為25～30℃；最適生長pH值為6～8；光照對病原菌的生長無明顯影響，但在全光照處理下產孢量最多；麥芽糖為最適產孢的理想碳源，病原菌對有機態氮和硝態氮利用效果較好。分生孢子萌發的最適溫度為20～30℃，最適pH值為6～7，最適RH為98%～100%，在1%葡萄糖液、水及莖瘤芥（榨菜）葉片浸漬液中萌發均較好，光照具有促進病原菌分生孢子萌發的作用。這一研究結果為進一步了解莖瘤芥（榨菜）黑斑病的發生規律和病害的防治提供了一定的理論依據。下一步的工作，應繼續進行病情調查及病害發生規律和流行趨勢的觀察,并對該病害進行藥劑和生防菌的篩選，以便提出綜合防治措施。

[1]王旭祎，徐興慧.涪陵莖瘤芥主要病害的發生與防治[J].長江蔬菜，2005，30-31.

[2]何士敏，向倩，周先容.莖瘤芥種子萌發期過氧化物酶的研究[J].安徽農業科學，2009，37（3）:951-955，989.

[3]張天宇.中國真菌志——鏈格孢屬（第十六卷）[M].北京:科學出版社，1998.

[4]王連平，王漢榮，茹水江，等.浙江省番茄早疫病菌生物學特性研究[J].浙江農業學報，2002，14（6）:320-325.

[5]杜云安，王朝暉，梁繼華，等.幾種藥劑防治香蕉葉斑病效果比較[J].安徽農業科學，2009，（27）:13131-13131，13191.

[6]劉開智，梅正鼎，王洪.細極鏈格孢菌蛋白激發子對棉花種子萌發及幼苗生長的影響[J].湖南農業科學，2010，（7）:13-14，17.