一種有效檢測水稻葉鞘低豐度蛋白的方法

王瑩,崔為同,楊明峰,沈世華＊

(1.中國科學院北京植物所,北京100093;2.中國科學院研究生院,北京100049)

蛋白質組學研究已成為21世紀生命科學的重要戰略前沿,《科學》雜志將其列為六大研究熱點之一[1]。在后基因組時代蛋白質組學發展迅速,對于探索基因功能日趨重要[2]。作為有力的分子生物學手段,蛋白質組學已被用來研究水稻(Oryza sativa)等作物生長發育和環境脅迫下蛋白質的表達[3-5]。

蛋白質組學研究中的關鍵步驟之一是樣品的制備和分離。盡管色譜、同位素親和標簽(ICAT)和蛋白微列陣等技術已成功應用于蛋白質組學分析[6,7],雙向凝膠電泳技術(2-DE)仍然是目前分析大量復雜蛋白樣品的常用工具[8]。樣品的制備是影響2-DE有效分辨率的關鍵因素,而蛋白分辨率可影響凝膠圖像質量和蛋白分布[9]。蛋白樣品的電泳分離常被一種或幾種含量極度豐富的蛋白干擾,這些“超高豐度蛋白”限制低豐度蛋白的分辨率[10],而且數量龐大,可遮蓋鄰近蛋白點或影響其他蛋白點的電泳遷移[11,12]。例如,核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(rubicso)是光合作用中CO2固定的關鍵酶,也是植物中含量最豐富的蛋白[13]。葉片中rubisco含量非常豐富,在電泳共遷移過程中影響或遮蓋鄰近蛋白點[14],進而降低2-DE對低豐度蛋白的檢測率。

降低樣品體系復雜性,分離富集低豐度蛋白質的各種預分離技術近年來發展較快,并與現有的分離技術相結合,大幅度提高了低豐度蛋白的檢測率[9,11,15-21]。但是,多數預分離技術比較昂貴或是耗時較長。PEG沉淀法是其中一種能夠簡單、快速地富集低豐度蛋白質的預分離方法。Sun等[22]采用20%PEG預處理水稻蛋白樣品,rubisco大亞基為主的高豐度蛋白被分離到沉淀部分,取得很好的分離效果;Xi等[23]采用PEG分離法檢測擬南芥(Arabidopsis thaliana)中低豐度蛋白,報道rubisco大亞基可被16%PEG沉淀;Lee等[24]采用15%PEG分離法檢測了水稻幼苗葉片中響應低溫脅迫的低豐度蛋白,取得了良好分離效果。

水稻、玉米(Zea mays)和小麥(Triticum aestivum)等禾谷類植物被廣泛研究[25-28]。葉鞘常被作為研究禾谷類作物庫源轉化的特殊器官[29],已有關于水稻灌漿期葉鞘蛋白質組學分析的報道[30]。葉鞘也進行一部分光合作用,因此該器官內也含有大量光合作用相關酶類,尤其是 rubisco的存在嚴重干擾葉鞘低豐度蛋白的檢測和分析,目前尚無提高葉鞘低豐度蛋白鑒定率的報道。本研究分別采用15%和20%PEG預分離法富集低豐度蛋白,旨在探索一種葉鞘低豐度蛋白的鑒定方法,為單子葉植物葉鞘蛋白質組學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將水稻9311(Oryza sativa ssp.indica cultivar 93-11)于正常水稻生長季節種植于北京中國科學院植物研究所實驗溫室內,常規水肥管理。自然光照下,生長70 d左右,待水稻生長至灌漿期,剪取水稻劍葉的葉鞘作為實驗材料,液氮速凍后儲藏于-80℃冰箱里。

1.2 蛋白質提取

1.2.1 Mg/NP-40法 蛋白質提取方法參照Kim等[31]的方法,略作修改。將0.5 g材料在液氮中研磨成精細的粉末,然后加入3 mL預冷的Mg/NP-40提取液[0.5 mol/L T ris-HCl(pH 8.3),2%(v/v)乙基苯基聚乙二醇(NP-40),20 mmol/L氯化鎂,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),2%(v/v)β-巰基乙醇],在冰上充分研磨。4℃下12 791 r/min離心勻漿液10 min,棄沉淀。上清液中加入4倍體積丙酮,-20℃沉淀30 min。相同條件下再次離心后,棄上清。沉淀用丙酮清洗,4℃下12 791 r/min離心10 min,清洗3次。將沉淀真空干燥即得到可溶性全蛋白干粉(NF)。

1.2.2 Mg/NP-40法(PEG預分離) PEG沉淀方法參照Kim等[31]和Yang等[32]的方法,并作修改。將0.5 g材料在液氮中研磨成精細的粉末,然后加入3 mL預冷的Mg/NP-40提取液,在冰上研磨充分。4℃下12 791 r/min離心10 min,棄沉淀。上清中加入50%(w/v)PEG-4000至終濃度為15%或20%(w/v)。混勻,冰上沉淀30 min。4℃下12 791 r/min離心10 min。離心后上清加入4倍體積丙酮,置于-20℃沉淀30 min。4℃下12 791 r/min離心10 min,取沉淀用丙酮清洗4次后真空干燥得到15%或20%PEG預分離上清組分(AF1或BF1)。離心后沉淀用丙酮清洗4次,真空干燥得到15%或20%PEG預分離沉淀組分(AF2或BF2)。

1.3 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳方法參照Yang等[32]的方法,略作修改。將蛋白干粉溶于裂解液:7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽,2%(v/v)兩性電解質(pH 3.5～10),5%(v/v)β-巰基乙醇,1%(w/v)二硫蘇糖醇。NF、AF1、AF2、BF1和BF2蛋白上樣量均為600 μ g。第一向等電聚焦(IEF)在長13cm、直徑3mm的玻璃管內進行。注射器灌膠[2%(v/v)NP-40,3.6%(w/v)丙烯酰胺,8 mol/L尿素,2.5%(v/v)兩性電解質(pH 3.5～10),2.5%(v/v)兩性電解質(pH 5～8)]。膠條聚合完全后,加入溶有蛋白樣品的裂解液,其上覆蓋30 μ L的50%裂解液。最后加入上槽電極緩沖液(20 mmol/L氫氧化鈉)及下槽電極緩沖液(6.67 mmol/L磷酸),等點聚焦200,400和800 V分別進行0.5,15和1 h。聚焦完畢后,從凝膠管中取出膠條,放入平衡緩沖液[62.5 mmol/L Tris-HCL(pH 6.8),2.5%(w/v)十二烷基磺酸鈉,10%(v/v)甘油,5%(v/v)β-巰基乙醇]中。振蕩平衡2次,每次15 min。然后轉移膠條至分離膠濃度為15%,濃縮膠濃度為5%的聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上端進行第二向垂直電泳。雙向電泳后,使用0.1%的考馬斯亮藍R-250(CBB-R-250)染色。

1.4 蛋白質凝膠掃描及圖像分析

脫色后的凝膠用UMAX掃描儀掃描。使用ImageMaster凝膠分析軟件對凝膠進行分析。

1.5 統計分析

所得數據經SPSS 14.0軟件統計分析。

2 結果與分析

2.1 2-DE圖譜

為測試PEG分離法是否適用于灌漿期水稻葉鞘低豐度蛋白的鑒定,分別將可溶性全蛋白(NF)、15%PEG預分離的上清蛋白(AF1)、15%PEG預分離的沉淀蛋白(AF2)、20%PEG預分離的上清蛋白(BF1)和20%PEG預分離的沉淀蛋白(BF2)進行2-DE(圖1)。

經ImageMaster 2D Platinum軟件分析,并計算各提取方法所檢測到的總蛋白種類(表1)。15%和20%PEG沉淀法預分離上清分別檢測到642和806個蛋白點,而沉淀分別檢測到882和695個蛋白點。TCA/丙酮法檢測到733個蛋白點,除去上清與沉淀中重疊的蛋白點,15%和20%PEG沉淀法檢測到的蛋白點分別為1 042和1 023個。15%和20%PEG沉淀法所得的蛋白點大概相同,均顯著(P<0.05)高于TCA/丙酮法檢測到的蛋白點數。

圖1 PEG預分離各組分與對照凝膠電泳圖譜Fig.1 Comparison of 2-DE gel electrophoresis protein patterns of Mg/NP-40 method with PEG fractionation(AF1,AF2,BF1,BF2)and no PEG fractionation(NF)

表1 不同分離方法的2-DE圖譜上蛋白點數Table 1 Number of spots of different methods

2.2 rubisco大亞基

NF的2-DE圖譜上rubisco大亞基蛋白點影響或遮蓋其周圍的蛋白點(圖2)。經PEG沉淀后AF1和BF1圖譜上的rubisco大亞基顯著減小(P<0.05)。采用ImageMaster 2D軟件分析,以計算rubisco大亞基相對蛋白點體積在經PEG沉淀后的變化(圖3)。未經PEG預分離的全蛋白圖譜上,rubisco大亞基占全部蛋白的16.9%。經15%PEG沉淀后,rubisco大亞基下降55.9%,20%PEG沉淀后下降92.7%?？梢?20%PEG沉淀rubisco的效果較好。

2.3 低豐度蛋白

與未經PEG分離提取的蛋白2-DE圖譜相比較,PEG預分離后上清蛋白2-DE圖譜上檢測到的蛋白點的數目增多。如圖4所示,僅在2-DE圖譜的B和C兩個小區域上,PEG預分離法的采用使得可檢測蛋白點的數目顯著增多。

參照Krishnan和Natarajan[33]的方法,將PEG預分離上清蛋白2-DE膠上表達上調3倍以上,且在可溶性全蛋白圖譜上很微弱或檢測不到的蛋白點,認為是PEG預分離法檢測到的低豐度蛋白點。使用ImageMaster 2D軟件,將AF1和BF1的2-DE圖譜分別與NF進行比較分析。結果顯示,AF1的2-DE膠上可檢測到低豐度蛋白點共有62個,而BF1可檢測到119個。顯然,20%PEG沉淀法可檢測到灌漿期水稻葉鞘中更多種類的低豐度蛋白。

圖2 PEG預分離法沉淀 rubisco大亞基效果Fig.2 PEG fractionation decreased rubisco large subunit in 2-DE analysis

圖3 不同分離方法2-DE圖譜rubisco大亞基相對豐度百分比Fig.3 Relative spot volume of rubisco large subunit using different methods

3 討論

在現今的蛋白質組學研究中,低豐度蛋白備受關注。細胞或組織中受體分子、信號分子等參與基因表達調控的蛋白均是低豐度蛋白,而在細胞中拷貝數眾多的高豐度蛋白,如rubisco等一般不參與基因調控[8]。結合雙向凝膠電泳的預分離技術已成為蛋白質組學中分析低豐度蛋白的有力工具。

圖4 PEG分離法增加2-DE圖譜上可檢測低豐度蛋白點數目Fig.4 15%and 20%PEG fractionation increased detectable proteins in 2-DE analysis

以rubisco為主的高豐度蛋白的存在嚴重影響葉片低豐度蛋白的檢測和分析,文獻報道PEG分離法主要是分離沉淀rubisco大亞基[22-24]。本研究采用簡便PEG預分離方法去除水稻葉鞘中的rubisco,探索適用于水稻葉鞘低豐度蛋白的檢測方法。前人報道證明PEG可有效分離沉淀rubisco,而不同樣品蛋白的預分離所需PEG濃度不同。本研究分別采用15%和20%PEG,以測定適用于葉鞘低豐度蛋白檢測的PEG濃度。

與未經PEG預分離的方法相比較,15%PEG沉淀可使rubisco大亞基相對蛋白點體積下降55.9%,而20%PEG沉淀法可降低92.7%。采用20%PEG預分離水稻葉鞘蛋白,可有效去除rubisco大亞基。PEG預分離的目的是富集低豐度蛋白,15%PEG沉淀法可檢測到62個低豐度蛋白,而20%PEG可檢測到119個。證明20%PEG對于灌漿期水稻葉鞘高豐度蛋白的減少和低豐度蛋白的富集效果顯著。與傳統的未經PEG預分離的TCA/丙酮法相比,采用15%和20%PEG分別預分離后經2-DE檢測到的全蛋白種類均顯著升高(P<0.05),而2種濃度PEG沉淀方法所檢測到全蛋白種類差異并不顯著。由此看來,20%PEG預分離方法不僅適于低豐度蛋白的鑒定,也適用于全蛋白表達的鑒定。

4 結論

PEG沉淀法是富集低豐度蛋白的方法之一。本研究采用水稻葉鞘為材料,分析了不同濃度PEG對rubisco的分離效果。研究發現,20%PEG分離法非常適合于鑒定水稻葉鞘中的低豐度蛋白,這些工作可為進一步研究水稻葉鞘差異蛋白質組學提供參考。

[1］曾嶸,夏其昌.蛋白質組學研究進展與趨勢[J].中國科學院院刊,2002,17(3):166-169.

[2］Phizicky E,Bastiaens,Zhu H,et al.Protein analysis on a proteomic scale[J].Nature,2003,422:208-215.

[3］Imin N,Kerim T,Rolfe B G,et al.Effect of early cold stress on the maturation of rice anthers[J].Proteomics,2004,4:1873-1882.

[4］Imin N,Kerim T,Weinman J J,et al.Low temperature treatment at the young microspore stage induces protein changes in rice anthers[J].Molecular Cellular Proteomics,2006,5:274-292.

[5］Yan S P,Zhang Q Y,Tang Z C,et al.Comparative proteomic analysis provides new insights into chilling stress responses in rice[J].Molecular Cellular Proteomics,2006,5:484-496.

[6］Adam G C,Sorensen E J,Cravatt B F.Chemical strategies for functional proteomics[J].Molecular Cellular Proteomics,2002,1:781-790.

[7］Templin M F,Stoll D,Schwenk J M,et al.Protein microarrays:promising tools for proteomic research[J].Proteomics,2003,3:2155-2166.

[8］G? rg A,Weiss W,Dunn M J.Current two-dimensional eletrophoresis technology for proteomics[J].Proteomics,2004,4:3665-3685.

[9］Lilley K S,Razzaq A,Dupree P.Two-dimensional gel electrophoresis:recent advances in sample preparation,detection and quantitation[J].Current Opinion in Chemical Biology,2002,6:46-50.

[10］Herman E M,Helm R M,Jung R,etal.Genetic modification removes an immunodominant allergen from soybean[J].Plant Physiology,2003,132:36-43.

[11］Cho J H,Hwang H,Cho M H,et al.The effect of DT T in protein preparations for proteomic analysis:removal of a highly abundant plant enzyme,ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase[J].Plant Biology,2008,51:297-301.

[12］Shaw M M,Riederer B M.Sample preparation for two-dimensional gelelectrophoresis[J].Proteomics,2003,3:1408-1417.

[13］Gutteridge S,Gatenby A A.Rubisco systhesis,assembly,mechanism,and regulation[J].Plant Cell,1995,7:809-819.

[14］Corthals G L,Wasinger V C,Hochstrasser D F,et al.The dynamic range of protein expression:a challenge for proteomic research[J].Electrophoresis,2000,21:1104-1115.

[15］Pier G R,Annalisa C,Ben H.Prefractionation techniques in proteome analysis[J].Proteomics,2003,3:1397-1407.

[16］Pier G R,Annalisa C,Paolo A.Prefractionation techniquesin proteome analysis:The mining tools of the thirdmillennium[J].Electrophoresis,2005,26:297-319.

[17］Peltier J B,Ripoll D R,Friso G,et al.Clp protease complexes from photosynthetic and non-photosynthetic plastids and mitochondria of plants,their predicted three-dimensional structures,and functional implication[J].Journal of Biological Chemistry,2004,279(6):4768-4781.

[18］Wienkoop S,Glinski M,Tanaka N,etal.Linking protein fractionation with multidimensional monolithic reversed-phase pep-tide chromatography/mass spectrometry enhances protein identification from complex mixtures even in the presence of abundant proteins[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2004,18:643-650.

[19］Espagne C,Martinez A,Valot B,et al.Alternative and effective proteomic analysis in Arabidopsis[J].Proteomics,2007,7:3788-3799.

[20］Kwanyuen P,Allina S M,Weissinger A K,et al.A new form of crystalline rubisco and the conversion too its common dodecahedral form[J].Joural of Proteome Research,2002,1:471-473.

[21］Widjaja I,Naumann K,Roth U,et al.Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low-abundance proteins differentially regulated during plant defense[J].Proteomics,2009,9:138-147.

[22］Sun T K,Kyu S C,Yu S J,et al.Two-dimensional electrophoresis analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays[J].Electrophoresis,2001,22:2103-2109.

[23］Xi J H,Wang X,Li S Y,etal.Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome[J].Phytochemistry,2006,67:2341-2348.

[24］Lee D G,Ahsan N,Lee S H,et al.An approach toidentify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf[J].Comptes Rendus Biologies,2007,330:215-225.

[25］蘇衍菁,趙國琦,王小山,等.不同生育期脆性突變水稻細胞壁組分動態研究[J].草業學報,2010,19(1):151-157.

[26］常宏,王漢寧,張金文,等.玉米品種真實性和純度鑒定的SSR標記多重PCR體系優化[J].草業學報,2010,19(2):204-211.

[27］邵宏波,梁宗鎖,邵明安.小麥抗旱生理生化和分子生物學研究進展與趨勢[J].草業學報,2006,15(3):5-17.

[28］惠文森,穆曉峰,王康英.草坪草屑葉蛋白質提取方法研究[J].草業科學,2009,26(3):108-110.

[29］Tatsuro H,Alexander E,Ryu O.Gene expression of enzymes for starch ad sucrose metabolism and transport in leaf sheaths of rice(Oryza sativa L.)during the heading period in relation to the sink to source transition[J].Plant Production Science,1999,2:178-183.

[30］李兆偉,熊君,李振方,等.水稻灌漿期葉鞘蛋白質差異表達分析[J].作物學報,2008,34(4):619-626.

[31］Kim S T,Cho K S,Jang Y S,etal.Two-dimensionalelectrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays[J].Electrophoresis,2001,22:2103-2109.

[32］Yang P F,Liang Y,Shen S H,et al.Proteome analysis of rice uppermost internodes at the milky stage[J].Proteomics,2006,6:3330-3338.

[33］Krishnan H B,Natarajan S S.A rapid method for depletion of Rubisco from soybean(Glycinemax)leaf for proteomic analysis of lower abundance proteins[J].Phytochemistry,2009,70:1958-1964.