通過花粉管通道法導入紅樹總DNA獲得耐鹽紫花苜蓿T0代植株及其RAPD驗證

張立全,牛一丁,郝金鳳,哈斯阿古拉

(內蒙古大學生命科學學院內蒙古自治區牧草與特色作物生物技術重點實驗室,內蒙古 呼和浩特010021)

土壤鹽堿化是一個世界性的問題,培育抗鹽轉基因作物新品種,充分利用鹽堿地,具有重要意義[1]。利用轉基因技術進行育種即可以有效地打破物種界限,又可達到定向改良植物的目的[2]。然而,植物的耐鹽性是多種耐鹽代謝、生理過程綜合表現的結果,受多個基因控制[3]。因此,培育轉基因耐鹽植物時,轉移單個基因往往只能獲得部分耐鹽性。為了獲得具有應用價值的耐鹽植物品種,可能需要直接轉移耐鹽供體基因組DNA,花粉管通道法(pollen-tube pathway)[4]轉基因技術的創建使其成為可能。利用鹽生植物DNA直接導入受體來培育耐鹽植物已有許多成功的報道。林棲鳳等[5-8]開展了耐鹽作物分子育種研究,將海岸鹽生植物紅樹(Rhizophora apiculata)DNA 導入番茄(Lycopersicon esculentum)[5]、豇豆(Vigna sesquipedalis)[6]、茄子(Solanum melongena)[7]、辣椒(Capsicum annuum)[8],獲得了耐鹽能力明顯增強的變異后代。肖軍等[9]將堿蓬(Suaeda salsa)總DNA導入番茄,獲得了抗鹽植株。以上研究證實直接轉移供體基因組DNA進行作物耐鹽性育種是可行的。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上栽培面積最大的優質豆科牧草[10,11],而利用基因工程技術來提高苜蓿抗寒、抗旱、耐鹽堿能力以及改良其營養品質已成為苜蓿發展和研究的新趨勢和重點[12]。張改娜和賈敬芬[13]將豌豆清蛋白1(PA1)基因轉入紫花苜蓿,結果顯示轉PA1基因再生植株中蛋氨酸和半胱氨酸的含量提高4倍。Winicov和Bastola[14]將轉錄因子基因Aflin1導入苜蓿,超表達Af lin1的愈傷組織可抵抗171 mmol/L NaCl的脅迫作用。燕麗萍等[15]對轉BADH基因T1代苜蓿的抗鹽性進行了研究,結果表明轉基因植株的耐鹽性明顯高于對照。以上研究均是利用農桿菌介導法,而且導入的均是單一基因,有關導入基因組DNA來培育苜蓿新品種尚未見相關報道。

本研究利用花粉管通道法,將鹽生植物紅樹總DNA直接導入紫花苜蓿,對獲得的T0代植株進行耐鹽性篩選和隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分子鑒定,旨在為紫花苜蓿耐鹽育種提供新的種質材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供體:鹽生植物紅樹采自深圳市紅樹海濱生態公園。

受體:紫花苜蓿阿爾岡金(Algonguin)品種,種子由中國農業科學院草原研究所于林清研究員提供,2005年種植于內蒙古大學生命科學學院花房試驗田。

1.2 方法

1.2.1 外源DNA的導入 十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法[16]提取紅樹總DNA,用 TE緩沖液(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,pH8.0)回溶,0.1×SSC(1×SSC:150 mmol/L氯化鈉,15 mmol/L檸檬酸鈉)稀釋至終濃度為250 ng/μ L,-20℃凍存備用。2007年6月和2008年6月連續2年的盛花期,在晴天上午8時選擇當天新開放的花朵,人工輔助異花授粉。授粉后24 h時切去1/2柱頭,用微量進樣器在柱頭切口處滴加5 μ L紅樹DNA溶液,共導入1 391朵,按常規方法進行栽培管理,莢果成熟時采摘收集T0代轉化種子。

1.2.2 T0代植株的鹽脅迫篩選 取未轉基因種子,砂紙輕輕打磨,70%酒精表面消毒10 min后,0.1%的升汞消毒10 min,無菌水沖洗4～5次,播種在NaCl濃度為0,50,75,100,125,150,175,200,225和250 mmol/L的MS培養基上,每個培養皿播種20粒種子,重復3次。培養2周后,統計發芽率。取T0代轉化種子,表面消毒后種植在含225 mmol/L NaCl的MS培養基上,培養2周后,將正常發芽且生長主根和真葉的植株移栽至不含NaCl的MS培養基上,培養3周,移栽至花盆,獲得耐鹽 T0代植株。

1.2.3 耐鹽性 T0代植株RAPD分析 取耐鹽性T0代植株葉片,采用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulphate,SDS)法提取DNA[17]。選用上海生工生物工程公司S編號的隨機引物55條,以紅樹DNA和未轉化紫花苜蓿DNA為模板,選出擴增產物清晰、穩定的引物,對耐鹽性T0代植株DNA樣品進行RAPD分析。PCR反應體系 25 μ L:10 ×緩沖液 2.5 μ L,MgCl2(25 mmol/L)2.0 μ L,dNTP(各 2.5 mmol/L)2.0 μ L,引物(5 pmol/μ L)2.0 μ L,DNA 模板 100 ng,Taq 酶(5 U/μ L)0.3 μ L,補蒸餾水至25 μ L。PCR 反應條件 :95 ℃預變性 5 min;95℃變性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸2 min,45個循環;72℃延伸7 min。PCR產物在3.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析,溴化乙錠染色后用凝膠成像儀觀察結果并拍照。試驗設2次重復。

2 結果與分析

2.1 T0代種子的獲得

2007和2008年2年共導入1 391朵花,獲得莢果445個,收集飽滿種子894粒,結莢率為32.0%,結籽率為2.01粒/莢。

2.2 T0代植株耐鹽性篩選

未轉基因種子在含0,50,75,100,125,150,175,200,225,250 mmol/L NaCl的MS培養基上種子發芽率分別為95.0%(圖1A),90.0%,85.0%,70.0%,47.5%,30.0%,22.5%,12.5%,0(圖 1B),0,即225 mmol/L 的NaCl濃度是篩選耐鹽性種子的適合濃度。

圖1 225 mmol/L NaCl篩選T0代植株Fig.1 T0seedlings selected by 225 mmol/L NaCl

將收獲的894粒T0代種子播種在含225 mmol/L NaCl的MS培養基上。培養2周后,有12粒正常發芽,且長有發育良好的真葉、主根和側根(圖1C)。移栽至不含NaCl的MS培養基上,培養3周,移栽至花盆,獲得耐鹽性 T0代植株,編號分別為:Ms-ra1～Ms-ra12。

2.3 RAPD分析

選用55條 RAPD引物對供體和受體基因組DNA進行PCR擴增,篩選得到清晰擴增產物、重復性好的8條引物(表1)。利用選定的8條引物對12株T0代植株進行RAPD分析,同時以供體DNA和受體DNA作對照。觀測所有的擴增電泳條帶,8條引物擴增出36條條帶,擴增產物分子量為0.17～2.50 kb(圖2)。多態性主要表現為供體和受體均沒有的新增條帶、供體特異條帶、受體條帶丟失3種情況(表2)。

表1 RAPD引物序列Table 1 Sequences of RAPD primers

圖2 RAPD分析圖譜Fig.2 The patterns of RAPD analysis

所獲得的12株植株均有大小不等的供體特異條帶出現(圖2,表2),S178引物在5個植株(Ms-ra3、Ms-ra6、Ms-ra8、Ms-ra11、Ms-ra12)中出現供體特異條帶,大小約 0.7和0.9 kb。S198在4個植株(Ms-ra1、Ms-ra5、Msra6、Ms-ra11)中均有供體特異條帶的出現,大小約為0.90 kb;S180在植株Ms-ra5和Ms-ra6中均出現了2條供體特異條帶,大小約為0.55和0.65 kb,而在植株Ms-ra2、Ms-ra4和Ms-ra11中也有約0.65 kb的供體特異條帶出現;S144在所有植株中都有約0.45 kb大小的供體特異條帶。除Ms-ra6、Ms-ra7、Ms-ra10和Ms-ra11外,其余均出現了供體和受體都沒有的新增條帶。S198在 5個植株(Ms-ra3、Ms-ra4、Ms-ra5、Ms-ra11、Ms-ra12)中出現了新增條帶,而有4個引物(S67、S105、S180、S144)在植株Ms-ra2中出現了新增條帶。同時,各植株均有受體條帶丟失現象,其中引物S178在所有轉化植株中都丟失約1.20 kb的受體條帶,S1407在各轉化植株中的受體條帶丟失現象更為明顯。

表2 RAPD多態性分析Table 2 The polymorphisms of RAPD analysis

3 討論

本研究以紅樹總DNA為供體,利用花粉管通道法獲得了紫花苜蓿耐鹽新種質,在225 mmol/L NaCl脅迫條件下,獲得12株正常生長的植株,而未轉基因種子在225 mmol/L NaCl脅迫時,不能正常發芽,表明已獲得了比對照耐鹽性顯著增強的T0代植株。

以PCR為基礎的RAPD技術可以檢測基因組上的微小差異[18],因此,RAPD技術已成為驗證外源DNA是否導入受體的有效手段,并有許多研究得到了證實[8,19,20]。本研究RAPD結果顯示,12個T0代耐鹽植株大多數條帶與受體一致,但也明顯出現有供體的特異條帶,表明已有外源DNA導入并整合到受體基因組中。由于外源DNA的導入并整合在受體基因組中,導致了后代基因組DNA在一級結構上發生改變,可能會改變導入后代基因組某些片段的引物結合位點,從而會導致新的DNA條帶出現或受體原有條帶丟失。這些結果表明供體紅樹DNA已整合在所獲得的12株耐鹽植株基因組中。

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