建立胱抑素C試劑盒不確定度分析方法

黃 儉 陳志偉 王軍峰

1.上海高鏡鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務中心，上海 200435；2.上海執(zhí)誠生物技術(shù)有限公司，上海 201204

近年來研究表明胱抑素C（Cys c）在評估腎小球過濾速度（GFB）中優(yōu)于血肌酐，Cys c在檢測方法上已從非均相法發(fā)展到自動化快速均相檢測法，顆粒增強透射免疫比濁法是以多克隆抗體為基礎的改良免疫比濁分析法，整個分析過程只需幾分鐘，可利用生化分析儀進行比濁測定，這些研究為Cys c在臨床廣泛應用奠定了基礎[1-2]。溯源是通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或測量標準的值能夠與規(guī)定的參考標準，通常是與國家標準或國際標準聯(lián)系起來的特性[3]。用于體外診斷的醫(yī)學器具，歐盟指出“溯源性”為具體的必備條件之一[4]。因此對體外診斷試劑進行溯源性分析是必然的趨勢。

測量不確定度表示指南（GUM）[5]是由國際標準化組織（ISO）、國際電工委員會（IEC）、國際計量局（BIPM）、國際法制計量組織（OIMI）、國際理論化學與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）、國際理論物理與應用物理聯(lián)合會（IUPAP）、國際臨床化學聯(lián)合會（IFCC）等7個最具權(quán)威性的國際學術(shù)團體聯(lián)合公布的標準。我國在1999年將其等同轉(zhuǎn)換為國家標準，編號為JJF1059-1999[6]。根據(jù)這一標準測量不確定度的定義是：表征合理賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)。為了使IVD試劑溯源過程更加容易理解，使溯源過程更具可操作性，本研究在不違背原定義的情況下將其解釋為：在某概率下，測量值的估計區(qū)間與真實值的估計區(qū)間之間最大的差距。這一差距涵蓋了被測量值的分散性，分散性越大不確定度越大。

目前溯源理論和技術(shù)已經(jīng)成熟，有很多研究可以借鑒[7-8]。但是體外診斷試劑又有其特殊性，因為在進行分析之前，首先要對測量系統(tǒng)進行校準（定標），以消除系統(tǒng)誤差。然而，定標品存在的不確定性，往往被人們忽略。本研究正是考慮了這一實際情況，并結(jié)合胱抑素C試劑盒定標的特點，提出了一個比較合適的方法用來評估定標過程引入的誤差，從而使試劑的不確定度更加完整。

1 材料與方法

1.1 儀器

紫外可見分光光度計（型號：日本島津2450）；BioRAD移液槍（20 μL）；Appendof移液槍（200 μL）；Appendof移液槍（1000μL）

1.2 試劑

胱抑素C（膠乳顆粒增強免疫比濁法）試劑盒（DENUO）；胱抑素C定標品（denka seiken co.，LTD），其不確定度由廠商提供。見表1。

表1 胱抑素C試劑盒定標品含量及其不確定度

以上定標品的不確定度可溯源至 DAKO Cytomation CystatinC Calibrator（product code：X0974， Cys-c 7.5 mg/L）。

1.3 溯源方法

不確定度計算過程一般包括：定義模型以確定輸入和輸出參數(shù)之間的關(guān)系；確定輸入量Xi的估計值xi；評估xi的不確定度u（xi）；計算輸出量和與之關(guān)聯(lián)的不確定度；計算擴展不確定度；輸出測量結(jié)果。其中不確定度傳遞見公式1。

2 結(jié)果

2.1 完成定標曲線

取5個校準品和水進行6點定標：以OD值為橫坐標，以已知的胱抑素C濃度為縱作標，制成標準曲線。見圖1。為了計算定標過程的不確定度，筆者對定標品重復取樣5次，并進行測量，因此每點是5個取樣值的平均。由圖1可知，使用4次非線性回歸可以取得最好的效果，擬合常數(shù)R=0.9998。擬合方程的形式為公式1。

2.2 校準模型不確定度的估計

通過統(tǒng)計軟件，一方面可以完成對曲線的擬合，計算出模型參數(shù)值，同時也可以給出參數(shù)估計值范圍和模型期望值范圍。見表2、圖2。

圖1 胱抑素C濃度與吸光值關(guān)系圖

表2 輸入?yún)?shù)及其不確定度（μL）

圖2 胱抑素C濃度與OD關(guān)系

軟件計算出來的誤差范圍很大，是因為不能給軟件提供最精練的計算公式，因此它會反復迭代利用輸入?yún)?shù)，導致參數(shù)和模型的不確定度呈幾何放大，因此軟件計算出的不確定度與實際情況不符合。為了在溯源過程中能夠考慮校準過程帶來的不確定度，筆者提供了一個比較簡單的估算方法：首先計算每個定標點的5個重復值的濃度估計區(qū)間和吸光值的估計區(qū)間（本研究都是在α=0.05時進行區(qū)間估計），這樣就得到了6組區(qū)間值，然后分別使用6組的最小值和最高值兩兩組合，進行曲線擬合，這樣便可得到4組擬合參數(shù)。見表3。之后將測量的吸光值分別代到這4個方程中，這樣計算出的濃度便是在4種可能的定標模型下的結(jié)果。然后再對這些可能的濃度進行區(qū)間估計。最后計算樣品區(qū)間與可能的真值區(qū)間之間最大的距離，這個最大距離就是在α=0.05時樣品濃度的分布范圍，既不確定度。參考值區(qū)間可以通過計算定標品和儀器引入的誤差進行計算。見表4。

2.3 試劑測量總不確定度估計

在試驗中筆者通過混合校準品得到胱抑素C濃度為1.0 mg/L混合“標準品”，再對其進行5次檢測。然后計算這些值的估計區(qū)間，再將區(qū)間上限和下限代入以上4個公式，計算出8個檢測值，然后對這8個值進行區(qū)間估計，得到計算值的范圍。見表5。

表3 定標模型參數(shù)擬合值

表4 校準品經(jīng)過處理后的濃度范圍（mg/L）

表5 總不確定度及擴展不確定度計算結(jié)果

因此，本試劑在測量1.0 mg/L樣本時的擴展不確定度為12.8%。

根據(jù)以上溯源方法，筆者對另外一批胱抑素C試劑進行了溯源：混合樣本理論濃度為0.75和4.5 mg/L時，測量結(jié)果的擴展不確定度分別為15.0%和4.8%。結(jié)果表明，試劑在不同濃度下的不確定度是不同的，主要是因為不同的樣本誤差不同，另外定標品的誤差傳遞到定標曲線上，在定標曲線上不同的位置會有不同的不確定度。

3 討論

3.1 模型成立假設條件

①純水中不含有胱抑素C；②在溯源過程一些條件，如溫度、濕度、壓力基本符合要求，整個測量過程時間較短，假設這些因素的波動不引入隨機誤差；③由于在測量之前對系統(tǒng)進行了校準，因此系統(tǒng)誤差會顯著降低，本研究假設系統(tǒng)誤差為0。

3.2 定標曲線對測量結(jié)果的影響

在溯源過程中如果不考慮定標曲線模型對計算結(jié)果的影響，必然對溯源的可靠性帶來不利影響，使計算的不確定度偏低。本研究分析了軟件提供的誤差與實際存在很大差距的原因是數(shù)據(jù)的反復迭代使用，因此很難直接計算出模型參數(shù)的誤差。在這樣的環(huán)境下，本研究提供了一個操作性很強的用于估計校準過程引入誤差的方法，通過使用這一方法筆者完成了胱抑素C的溯源性分析。

3.3 試劑測量過程的不確定度

試劑的不確定度反映了分析結(jié)果的分散性，本研究將其解釋為：在某概率下，可能的測量值與可能的真實值之間最大的差距，這一闡釋在沒有違背原定義的情況下，使溯源過程更加容易理解，增強了IVD試劑溯源過程的可操作性。試驗證明測定不同濃度的樣本，不確定度會不同，這并不能說明被檢試劑性能不穩(wěn)定，因為這個差距往往來自于不確定度互不相同的定標品之間。另外仍需說明，某次的溯源結(jié)果并不能代表整個試劑全部使用過程的不確定度，因為操作不同，使用的儀器不同，使用的定標方法不同，都可能引入大小不一的誤差。

綜上所述，本研究提出了一個適用于解決體外診斷試劑溯源的方法，實踐證明，本研究提供的方法增強了IVD試劑溯源過程的可操作性。

[1]蔡鋼強，垢敬，焦連亭.血清胱抑素C濃度判斷腎小球濾過功能的應用評價 [J].臨床檢驗雜志，2002，20（3）：159-160.

[2]張翀，丁進芳，韓平治.胱抑素C的檢測方法及臨床應用進展[J].中國醫(yī)學檢驗雜志，2004，5（8）：330-332.

[3]Medical laboratories.Particular requirements for quality and competence[J].International Standard ISO 15189，2003：1-4.

[4]In Vitro diagnostic medical devices. Directive 98/79/EC of European Parliament and of the Counlil of 27 ctober 1998 on in ritro diagnostic medical devices[S].official Joumal 331,1998-07-12.

[5]ISO/IEC Guide 98.ISO standard A Guide to Expression of Uncertainty in Measurement[S].2008..

[6]楊振華.關(guān)注測量不確定度在臨床檢驗中的應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2007，30（5）：965-966.

[7]莫姿麗，黃諾嘉.紫外分光光度法測定維生素B1片含量的不確定度分析[J].海峽藥學，2009，21（3）：87-89.

[8]毛如增，馮典英.化學計量中的不確定度[J].化學計量,1997，6（5）：11-13.