重組Runx3腺病毒聯合順鉑對小鼠肝癌移植瘤生長抑制作用研究

張 靜,任松森,許光華,張海元 (長江大學醫學院,湖北荊州434023)

肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)是人類常見的消化道惡性腫瘤,其發生發展同其它惡性腫瘤一樣存在細胞周期調控基因的改變。在利用順鉑 (cisplatin,DDP)等化療藥物治療過程中,因化療藥物毒副作用較大并經常產生耐藥性,影響化療效果。近年來人們從改變細胞周期著手抑制腫瘤細胞生長開展了多種研究[1-3],實驗證明p21、FUS1等抑癌基因能明顯增強腫瘤細胞對順鉑等化療藥物的敏感性。重組腺病毒介導的基因治療最為廣泛且安全可行,本研究擬采用低劑量的順鉑和重組Runx3腺病毒聯合應用于小鼠的人腫瘤模型,以探討其在動物體內是否具有協同作用,從而在今后臨床治療中,通過聯合用藥減少肝癌患者順鉑的使用劑量,降低順鉑對患者的毒副作用及耐藥性。通過本項目的實施,有望獲得全新的抗肝細胞癌生物治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料

H22肝癌細胞株由新加坡國立大學腫瘤研究所饋贈,小鼠腹水傳代。6～8周齡健康小鼠40只,雌雄各半,體質量18～22g。DDP購于錦州九泰藥業公司,空腺病毒Ad(GFP+)由四川大學饋贈,Ad-Runx3由本課題組構建。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠模型的建立 無菌操作,取H22小鼠腹水,臺盼藍染色,光鏡下瘤細胞計數,活瘤細胞＞90%,調整細胞濃度為5×106個/ml,分別取0.2ml于右腋皮下注射,制成實體型荷瘤鼠模型,2周后于小鼠右腋皮下形成H22肝癌細胞系移植瘤。

1.2.2 實驗分組與治療 20只荷瘤小鼠隨機分成4組,即對照組 (生理鹽水0.2ml)、Ad-Runx3組(3×1010pfu/ml)、DDP組 (10mg/kg)、聯合治療組 (Ad-Runx3+DDP組),每組5只。其中Ad-Runx3實施瘤體內注射,而生理鹽水或DDP分別進行腹腔內注射,每周2次,共2周。在最后一次注射治療結束后第2周,用頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠,觀察各項指標。

1.2.3 稱取瘤重并計算腫瘤抑制率 小鼠處死后分別取出腫瘤瘤體,剝離干凈后用濾紙擦拭干凈,電子天平稱取瘤質量,并按公式計算抑瘤率。抑瘤率 (%)=(1-實驗組瘤質量/對照組瘤質量)×100%。

1.2.4 腫瘤組織細胞超微結構的電鏡觀察 切取上述各組小鼠腫瘤組織,分別經40g/L戊二醛及10g/L四氧化鋨預固定和固定后,用乙醇及丙酮逐級脫水,環氧樹脂包埋,制作0.5μ m厚薄切片,醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛染色,利用透射電鏡觀察。

1.3 統計學分析

應用SPSS13.0軟件進行數據處理,采用方差分析檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 順鉑聯合Ad-Runx3對肝癌移植瘤的抑制作用

聯合治療組 (Ad-Runx3+DDP)小鼠腫瘤生長明顯受到抑制,移植瘤質量為 (0.97±0.19)g,抑瘤率為65.7%;DDP組移植瘤質量為 (1.56±0.17)g,抑瘤率為45.3%;Ad-Runx3組移植瘤質量為(1.72±0.21)g,抑瘤率為42.6%;對照組移植瘤質量為 (2.65±0.26)g。治療組與對照組比較具有統計學差異 (均P＜0.05),聯合治療組 (Ad-Runx3+DDP)與Ad-Runx3組或DDP組比較差異具有統計學意義 (均P ＜0.05)。

2.2 H22移植瘤超微結構的變化

透射電鏡觀察結果顯示,對照組大部分細胞結構完整,常染色質豐富;順鉑治療組可見細胞大量壞死,未見明顯細胞凋亡指征;Ad-Runx3治療組可見部分早期凋亡細胞;Ad-Runx3+順鉑聯合治療組可見明顯的凋亡小體結構,細胞質密度增高,染色質高度凝集固縮。

3 討 論

Runx3基因 (runt-related transcription factor gene)是近年來發現的一種新型抑癌基因,與人類多種腫瘤的發生、發展有著極其密切的關系,受到國內外學者的廣泛關注。Runx3基因在消化道上皮細胞生長調控中起著重要作用,能抵抗TGF-β誘導的生長抑制和細胞凋亡,調控消化道上皮細胞分化,Runx3基因的不正常表達與胃癌、結腸癌、膽道腫瘤等消化道惡性腫瘤發生密切相關。據Song等[4]報道,原發性肝癌也存在著嚴重的TGF-β信號轉導障礙,這說明Runx3基因可能在肝細胞肝癌 (HCC)的發生發展過程中是關鍵性的腫瘤抑制基因,其功能失活可導致TGF-β/SMADS信號通路削弱。順鉑是臨床應用最為廣泛的一種抗癌藥物,近年來,應用順鉑治療消化道惡性腫瘤取得了長足進展。有研究表明,順鉑類化療藥物治療腫瘤的機制之一是通過P53依賴途徑而誘導細胞凋亡來實現對腫瘤細胞的殺傷[5]。順鉑類化療藥物可使腫瘤細胞的DNA受損傷,損傷的DNA啟動p53基因,使細胞進入G1期生長抑制,并誘導損傷嚴重的細胞進入凋亡狀態。順鉑副作用較大,順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴重損害,另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時易引起耐藥性。臨床上采用了多種聯合化療方案,大部分具有減毒增效作用。

腺病毒是腫瘤基因治療最具應用前景的載體之一[6],腺病毒載體感染腫瘤細胞時,不依賴細胞周期,表達水平高,且不會發生隨機整合,安全性好。本研究以復制缺陷型腺病毒為載體,構建重組Runx3腺病毒 (Ad-Runx3)。通過在小鼠體內移植肝細胞癌,并分別采用化療藥物順鉑、Ad-Runx3及聯合用藥 (DDP+Ad-Runx3)等方法進行治療,結果顯示,聯合治療組小鼠腫瘤生長明顯受到抑制,移植瘤質量為 (0.97±0.19)g,抑瘤率達到65.7%,與順鉑治療組和Ad-Runx3治療組比較差異具有統計學意義,本實驗結果說明化療藥物順鉑和Ad-Runx3聯合應用在抑制干細胞癌瘤體生長和增加抑瘤率中都發揮明顯療效,顯著抑制干細胞癌的增殖生長,起到明顯的協同效應。在使用投射電鏡觀察移植瘤超微結構來看,聯合治療組可見凋亡小體,細胞質密度增高,染色質高度凝集固縮,相較于單獨使用順鉑組或Ad-Runx3組而言,凋亡特征非常明顯。

通過本實驗的研究,我們認為聯合應用Ad-Runx3及化療藥物順鉑治療小鼠肝細胞癌移植瘤,可能通過不同途徑及機制作用于肝癌細胞,加速腫瘤細胞凋亡,為肝細胞癌的生物治療提供新的靶點和全新的聯合用藥方案。

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