綠原酸提取分離及檢測研究進展

周 舟 (湖南農業大學園藝園林學院,湖南長沙41 01 28)

彭 淼 (湖南農業大學東方科技學院,湖南長沙41 01 28)

鐘曉紅 (湖南農業大學園藝園林學院,湖南長沙41 01 28)

綠原酸作為一種具有多種生物活性的天然物質,已引起國內外學者廣泛關注,其提取純化及檢測技術的研發已成為當前日益關注的焦點。以前多采用單一的某種方法來提取綠原酸,目前則以多種方法相結合。張凌裳等[1]用酶解和超聲相結合的方法,對綠原酸的提取工藝條件進行了優選。

在天然產物化學中,綠原酸類化合物屬于發現早、分類廣的一類化合物,它們具有分布廣、活性強的特點。由于具有抗氧化、抗病毒和抑制6-磷酸葡萄糖轉移酶等功效,因此綠原酸類化合物不僅可以作為藥物,也是食品和飲料中重要的藥補成分。另外,作為酚型抗氧化劑,它還有望成為良好的天然食品添加劑[2]。目前,隨著綠原酸的生物活性越來越受到人們的重視,對它們的應用已經逐漸深入到食品、保健、醫藥和日用化工等多個領域。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物[3]。它是許多中藥材的有效成分之一,又是某些中成藥的質量指標,并且在日用化工、食品等領域都有廣泛的應用。綠原酸主要存在于忍冬科忍冬屬 (Lonicera)、菊科篙屬 (Artemisia)植物中[4],主要包括杜仲、金銀花、白日葵、咖啡、可可樹。另外,水果中有蘋果、梨,蔬菜中有馬鈴薯,以及大豆、小麥、綠茶等日常食用品中都含有微量的綠原酸類物質[5]。為了給綠原酸提純和檢測的深入研究以及應用提供參考,筆者從綠原酸的提取、分離純化、檢測等方面的研究進展作綜述。

1 綠原酸的提取方法

目前綠原酸的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波提取法、超臨界CO2萃取法和酶提取法等。在工藝化生產上則是以多種方法相結合為主[6]。

1.1 溶劑提取法

在溶劑提取法中,根據提取溶劑的不同可分為水提法與有機溶劑提取法。綠原酸為極性有機酸酯,在提取過程中,可能通過水解和相繼分子內酯基遷移而發生異構化[7]。因而用水作溶劑時,會出現綠原酸含量降低,從而導致綠原酸得率下降。而在用有機溶劑提取時,綜合各方面原因,一般采用乙醇提取,并且在醇溶液中,酶的催化分解作用會受到抑制,使得綠原酸穩定性增強。

(1)水提法 王茜等[8]探討了水以及不同濃度乙醇、甲醇和丙酮水溶液作為提取溶劑對杜仲葉中綠原酸得率的影響,最終確定水作為綠原酸提取溶劑。水提杜仲葉綠原酸的最佳工藝條件為:提取溫度60℃,料液比1∶16,pH 4,提取時間3 h。

(2)有機溶劑提取法 左航等[9]通過單因素試驗和正交試驗優化了杜仲葉中綠原酸的提取條件,由試驗結果可知,杜仲葉中綠原酸提取的最佳工藝組合為:提取溫度90℃,乙醇水溶液體積分數為70%,料液比1∶16,提取1.5 h。由極差分析可得,提取時間的影響最大,其次是料液比,提取劑中乙醇的含量,提取溫度的影響最小。

1.2 物理因素提取法

在物理因素提取法中,有超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超高壓提取法等提取方法。這主要是利用超聲、微波、高壓等物理因素所具有的機械效應、空化效應、生物效應、熱效應來有效的提高活性物質的提取效率和得率。

(1)超聲提取法 周軍等[10]用超聲波法提取金銀花中的綠原酸,并與傳統的水提、醇提工藝進行了比較,采用薄層層析法定性檢驗,紫外分光光度法測定綠原酸的含量。結果表明,超聲波法的提取率高于傳統溶劑提取法。在pH為4的70%乙醇中預浸泡24 h,料液比為1∶10,再用超聲波提取4次,每次30 min,綠原酸收率最高含量可達9.58%。

(2)微波輔助提取法 童玲等[11]分別用微波輔助提取、超聲輔助提取、冷凝回流提取、室溫冷浸提取4種方法提取杜仲葉中的綠原酸,并將4種提取方法進行比較,結果顯示提取率分別是21.07%、8.94%、7.23%、5.13%。可以看出微波輔助提取效率明顯高于超聲輔助提取法和傳統提取法。微波輔助提取時的最佳條件是:乙醇體積分數60%、固液比1∶50、輻射時間2 min、微波壓力2 atm。

(3)超高壓技術提取法 田龍[12]對杜仲葉綠原酸的提取工藝方法進行了研究。建立了杜仲葉綠原酸超高壓提取方法,以分光光度法為檢測手段,以綠原酸的提取率為參數并將超高壓提取法在提取時間、提取劑用量和提取率等方面與索氏回流和浸泡提取方法各方面進行了比較。最佳工藝條件為:溶劑為體積分數60%的乙醇,壓力為400 MPa,杜仲葉粉末每克溶劑添加量為40 mL,溫度為50℃。該條件下提取率為1.15%。

1.3 酶法提取

戴瑜等[13]研究了半纖維素酶法提取杜仲葉中的主要有效成分綠原酸,通過單因素試驗、正交試驗和方差分析確定了半纖維素酶法提取杜仲葉中綠原酸的最佳提取條件。即加入996 U/g半纖維素酶0.45%,提取pH為4.0,溫度為40℃,得率最高可達38.01 mg/g。這種條件下半纖維素酶能發揮最大的催化效果,也能夠較大地增加杜仲葉中綠原酸的得率。由于酶解的作用是使植物材料降解,使植物的有效成分更多的溶出,因此檢測指標綠原酸得率的增加,標志著杜仲葉有效成分的得率也相應的增加。基于酶解提取法的操作簡單、污染少、得率高等優點,使得酶解提取法在綠原酸的提取分離研究中將得到廣泛的應用。

1.4 超臨界CO2流體萃取法

超臨界CO2流體萃取法作為一種將提取分離同時進行的萃取技術目前也廣泛的被運用到綠原酸的提取分離中。譚偉等[14]對超臨界CO2萃取葵粕綠原酸的影響因素 (夾帶劑種類、濃度、用量、萃取溫度、壓力、時間以及CO2流量)進行了詳細的分析和討論。結果表明,以上因素對綠原酸萃取率都有一定的影響,在各單因素試驗條件下選擇乙醇作為夾帶劑、乙醇濃度70%、乙醇用量400 mL/100 g、萃取溫度50℃、萃取壓力30 MPa、萃取時間5 h和CO2流量3.5 L/h為好。

2 綠原酸的分離純化方法

2.1 萃取法

陳立鋼等[15]通過流動注射的方法將動態微波輔助萃取與高效液相色譜相連接,用于測定金銀花中的綠原酸,萃取過程在一個循環體系中完成。選擇體積分數為60%的甲醇作為萃取劑,70 W的微波前向功率微波萃取5 min,并設定萃取劑流量為1 mL/min。在24 h內,連續分析6個樣品,得到的日間精密度 (RSD)為3.4%。24 h分析2個樣品,連續分析3 d得到的日間精密度 (RSD)為4.1%。在3個實際樣品中分別加入一定量的綠原酸標準溶液,充分混勻,放置24 h后,用N2揮干溶劑,在上述選擇的最佳條件下進行測定。每個加標樣品分析2次,得到的平均加標回收率為98.1%,RSD為2.7%。

2.2 水提醇沉法

鄭喜群等[16]研究了水提醇沉法從葵花籽中提取綠原酸的工藝,結果表明,水酶法提取葵花籽油脂后分離出的浸泡液進行真空濃縮到固形物含量為13%時,加入此時溶液量1倍的95%乙醇2次,沉降多糖,然后繼續真空濃縮,冷卻可析出純度為75.9%以上的綠原酸。

2.3 大孔樹脂吸附法

李丹等[17]利用NKA-9大孔吸附樹脂對元寶楓綠原酸的吸附與洗脫性能進行了研究。結果表明:NKA-9樹脂對元寶楓綠原酸具有較大的吸附容量,且易被解吸附,洗脫峰集中,分離效果較好。同時得到分離純化的最佳條件為:進樣液質量濃度0.26 mg/mL,pH為2.5,進樣液體積為樹脂柱床體積的4～5倍,體積流量1.5 mL/min。用體積分數30%、4倍床體積的乙醇對樹脂進行洗脫,可得到純度為26.62%的綠原酸粗品,收率達83.69%。

2.4 聚酰胺柱層析法

游慶紅等[18]對金銀花中綠原酸的提取和純化方法進行研究。在純化試驗中選用乙酸乙酯萃取法和聚酰胺層析法,取3份采用最佳工藝條件提取的樣品溶液5 mL,緩慢轉移至裝有3 g已處理過聚酰胺粉的層析柱中,分別用濃度10%、30%和50%乙醇溶液洗脫,以2 mL/min的流速使柱內液面高度保持在1～2 cm。每隔20 min采樣1次并測定樣品溶液中綠原酸的含量,從而繪制洗脫曲線。得出純化的最佳方案,并對聚酰胺層析的層析條件和不同洗脫劑的洗脫效果進行考察。試驗表明,乙酸乙酯萃取法純化后綠原酸純度為18.4%;吸附有綠原酸的聚酰胺以濃度30%的乙醇洗脫效果較好,得到的綠原酸純度為33.2%。

2.5 膜分離法

楊祖金等[19]研究了超濾膜技術應用于杜仲葉綠原酸的分離純化。以綠原酸轉移率為指標,考察料液溫度、超濾壓力、超濾時間、膜截留分子量對綠原酸轉移率的影響。正交實驗結果表明,料液溫度為40℃、超濾壓力為0.36 MPa、超濾時間為60 min,膜截留分子量為200 000時,綠原酸轉移率最高為67.57%,通過繼續加入24 L的去離子水進行超濾,綠原酸的轉移率可高達99.38%。

3 綠原酸的檢測方法

目前,隨著分析檢測技術的快速發展,傳統的檢測方法比如薄層色譜、分光光度法等逐漸地被精確的檢測方法所取代。比如,高效液相色譜法、氣象色譜法等已經成為主流的檢測方法。這些方法相對于傳統方法,得到的試驗數據更精確,試驗結果更準確。

3.1 分光光度法

孫蓮等[20]研究了利用紫外分光光度法測定桑葉中綠原酸的含量,并建立薄層-紫外分光光度法測定桑葉中綠原酸的方法。采用甲醇為溶劑提取桑葉中的綠原酸,薄層層析法分離綠原酸,采用 T U-1800SPC型紫外分光光度計于329 nm處測定綠原酸的含量。結果綠原酸的質量在50～250 μ g范圍內與吸光度成良好的線性關系 (r=0.999 6),平均回收率為95.0%,RSD為1.2%。

3.2 薄層色譜掃描法

李春紅等[21]采用薄層色譜法對川銀花中綠原酸的含量進行了分析測定,以建立川銀花的質量控制標準。試驗結果顯示,綠原酸在0.8～8 μ g范圍內具有良好的線性關系 (r=0.999 8),平均回收率為98.75%,RSD為0.29%。

3.3 高效液相色譜法

李紅梅等[22]利用高效液相色譜法對蒲公英提取物中綠原酸含量進行了測定。采用Agilent Zorbax SB C18柱 (416 mm×250 mm,5 μ m),流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液 (10∶90),流速110 mLmin-1,檢測波長324 nm,柱溫30℃。結果顯示:綠原酸的線性范圍為0.04～0.60 μ g(r=0.999 2),平均加樣回收率(n=5)為96.48%。

李鑫等[23]利用高效液相色譜法測定甘薯葉中綠原酸含量,并建立了測定甘薯葉中綠原酸含量的高效液相色譜方法。采用色譜柱 Lichrospher5-C18柱 (150 mm×4.6 mm,5 μ m),以A(水∶乙腈∶冰醋酸=980∶20∶5)(V∶V∶V),B(乙腈∶冰醋酸=1 000∶5)(V∶V)為流動相,線性梯度洗脫,流速0.3 mL/min,檢測波長324 nm。結果表明,綠原酸在5～100 μ g/mL時,綠原酸質量濃度與峰面積呈良好的線性關系,回歸方程為y=195.47x+144.29(r=0.999 1),平均回收率可達93.1%。

3.4 氣相色譜法

別立潔等[24]對煙草中的主要成分綠原酸進行了定量分析,并建立了測定煙草中綠原酸含量的氣相色譜方法。采用HP-6890氣相色譜儀,色譜柱:HP-5(Crosslinked 5%pH ME Siloxane),30 m×0.32 mm×0.25 μ m Film Thickness毛細管柱,流速:6 mL/min,溫度:180℃ (保持 2 min)升溫到250℃(5℃/min),載氣:N2,檢測器:FID。

3.5 毛細管電泳法

趙陸華等[25]采用未涂層毛細管柱,濃度為200 mmol硼酸與質量分數為10%甲醇為緩沖液,分離電壓為30 kV,檢測波長為328 nm,溫度為25℃,進樣條件為50 kPa,5.0 s。在此條件下測定鳥骨藤藥材及其制劑中綠原酸的含量。結果表明,綠原酸質量濃度為21.0～105.0 μ g/mL的線性關系良好(r=0.999 7),平均回收率為99.16%,RSD為0.8%。

4 結語

綜上所述,綠原酸的提取技術以物理因素輔助溶劑提取為主,而酶法提取則是近期開發的一種新興提取技術;純化技術以萃取技術和樹脂分離技術相結合,近年來,超臨界流體萃取法作為一種將提取和純化同時進行的高效技術越來越多的被運用到綠原酸的分離純化上;隨著分析檢測技術的快速發展,傳統的綠原酸檢測方法比如薄層色譜、分光光度法等逐漸地被高效液相色譜、氣相色譜等精確的檢測方法所取代。近年來,隨著技術的快速發展與成熟,對于綠原酸各方面的研究也日趨完善,但是由于這類化合物存在多個酚羥基,所以對光、氧氣、pH、溫度、酶等因素都比較敏感,在提取、加工以及后續的檢測中會生成人工產物,這樣不僅會影響藥效,也會影響食品或飲料的質量。所以,有必要對相應的研究方法及過程進行探討。通過深入研究,必將找到簡單易行、收率高、檢測方便的方法,將有助于推動對于綠原酸的研究以及相關的產品開發。

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