天山花楸果實(shí)多糖的提取工藝優(yōu)化

努爾阿米娜·阿布都肉蘇，嚴(yán) 雯，白 潔，帕提古麗·馬合木提

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

天山花楸果實(shí)多糖的提取工藝優(yōu)化

努爾阿米娜·阿布都肉蘇，嚴(yán) 雯，白 潔，帕提古麗·馬合木提*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

為確定以花楸果實(shí)多糖的提取工藝，先用分光光度法測(cè)定超聲提取的天山花楸不同部位多糖的含量，再設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)篩選超聲提取天山花楸果實(shí)多糖的最佳工藝條件。結(jié)果表明：天山花楸各部位中果實(shí)含糖量最高，為4.63%。最佳工藝條件為以95%乙醇溶液醇沉、料液比1:45(g/mL)、超聲時(shí)間45min、超聲功率240W，天山花楸果實(shí)中多糖含量可達(dá)到5.92%。其中，料液比是影響天山花楸多糖得率的顯著性因素。

天山花楸；多糖；提取工藝

天山花楸(Sorbus tianschanica Rupr.)薔薇科花楸屬植物，是一種傳統(tǒng)的民族藥用植物。其果實(shí)味甘苦、性平、無(wú)毒。嫩枝和皮味苦、性寒、無(wú)毒。具有清肺止咳、補(bǔ)脾生津、補(bǔ)血補(bǔ)氣、治肺結(jié)核、哮喘咳嗽、胃炎、胃痛及VA、VC缺乏癥等功效[1]。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)天山花楸不同部位多糖含量測(cè)定的結(jié)果，選取得率較高的果實(shí)多糖作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。深入研究其提取工藝，以拓寬天山花楸的研究領(lǐng)域，為天山花楸多糖的進(jìn)一步深入開發(fā)研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2008年8月新疆烏魯木齊南山羊圈溝采集的天山花楸根、莖、葉和成熟果實(shí)，經(jīng)植物教研室鑒定，自然條件下干燥粉碎過(guò)20目篩，貯藏于干燥器中備用。

葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)品)、蒽酮、乙醚、無(wú)水乙醇、丙酮、濃硫酸、正丁醇、氯仿等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LAC164分析天平(精確至0.0001g) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；JY9Z-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；S24可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備[2-3]

分別稱取樣品5g，脫脂濾紙包好，150mL乙醚45℃水浴在索氏提取器中回流脫脂，直至醚層無(wú)色。待揮干乙醚后，加入125mL蒸餾水，160W超聲提取25min。過(guò)濾，50℃減壓濃縮，Sevag法除蛋白(氯仿-正丁醇4:1，濃縮液-有機(jī)溶劑3:1。劇烈振蕩30min，4000r/min離心15min，取上清液)，反復(fù)進(jìn)行直至無(wú)蛋白層后，加3倍量95%乙醇封存于2℃冰箱中過(guò)夜，離心(6000r/min，15min)，多糖沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、無(wú)水乙醇洗滌(兩次)，60℃干燥，即為所得的多糖。蒸餾水定容至50mL，移取1mL，蒸餾水定容至25mL，即為所得的樣品溶液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液母液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分別置于10mL的容量瓶中，蒸餾水定容。各取1mL于試管中，搖勻，置冷水浴中，加新配的0.2%蒽酮-硫酸溶液(棕色瓶冰箱中)4mL，搖勻，沸水中煮7min，取出，自來(lái)水迅速冷卻至室溫，放置10min。以相應(yīng)試劑為空白參比[2-3]，在波長(zhǎng)590nm處測(cè)定吸光度，相應(yīng)試劑為空白參比，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度(C)/(mg/ mL)為橫坐標(biāo)作圖，得回歸方程。

1.3.3 換算因子的測(cè)定[4]

稱取天山花楸果實(shí)粉末5g按照1.3.1節(jié)操作，制得干燥質(zhì)量恒定的多糖顆粒，精確稱取35mg置250mL容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，搖勻，吸取1mL于試管中，按照1.3.2節(jié)操作，波長(zhǎng)590nm處測(cè)定吸光度，相應(yīng)試劑為空白參比。所測(cè)樣品吸光度(n=5)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算后，得出溶液中葡萄糖濃度，按下式計(jì)算換算因子：

式中：m為稱取多糖的質(zhì)量/mg；C為根據(jù)回歸方程所算得的溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(mg/mL)；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 樣品多糖的含量測(cè)定

取天山花楸根、莖、葉、果實(shí)樣液1mL于試管中按照1.3.2節(jié)操作測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品按照該法平行測(cè)定5份，取其平均值。所測(cè)樣品吸光度經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算后，得出溶液中葡萄糖質(zhì)量濃度，然后按下式計(jì)算多糖的得率。

式中：C為根據(jù)回歸方程所算得的溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(mg/mL)；f為換算因子；m為天山花楸不同部位樣品干質(zhì)量/g；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.5 提取工藝研究

1.3.5.1 天山花楸果實(shí)多糖提取的單因素試驗(yàn)

影響多糖得率的因素很多，主要有乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率[5]。對(duì)以上4因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，為正交試驗(yàn)選取因素與水平。

乙醇體積分?jǐn)?shù)采用55%、65%、75%、85%、95%五個(gè)水平，在料液比1:25(g/mL)、超聲時(shí)間25min、超聲功率160W條件下，提取并測(cè)定多糖含量。

料液比采用1:15、1:25、1:35、1:45、1:55五個(gè)水平，在超聲時(shí)間25min、超聲功率160W及所確定的最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)的條件下，提取并測(cè)定多糖含量。

超聲功率采用80、160、240、320、400W五個(gè)水平，在超聲時(shí)間25min以及所確定的最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)和最佳料液比的條件下，提取并測(cè)定多糖含量。

超聲時(shí)間采用15、25、35、45、55min五個(gè)水平，在所確定的最佳醇沉體積分?jǐn)?shù)、最佳料液比和最佳超聲功率條件下，提取并測(cè)定多糖含量。

1.3.5.2 天山花楸果實(shí)多糖提取正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以多糖得率為指標(biāo)，選取影響多糖得率的主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定天山花楸果實(shí)多糖提取的最佳工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的得出

以1.3.2節(jié)所測(cè)的吸光度(A)為縱坐標(biāo)、溶液濃度(C)/ (mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A= 49.804C+0.0042，R2=0.9988。

2.2 換算因子的測(cè)定結(jié)果

將1.3.3節(jié)所測(cè)得的多糖吸光度(A)平均值0.485代入回歸方程，并按照1.3.3節(jié)公式計(jì)算換算因子：f=2.90。

2.3 樣品多糖含量的測(cè)定結(jié)果

天山花楸不同部位多糖的含量結(jié)果見表1。

表1 天山花楸不同部位多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=5)Table1 Polysaccharide contents of different parts of Sorbus tianschanica Rupr.

2.4 單因素對(duì)果實(shí)多糖得率的影響

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

如圖1所示：多糖得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而明顯上升，95%的得率最高。因此選擇95%乙醇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的乙醇沉體積分?jǐn)?shù)。

圖1 乙醇沉體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of polysaccharides

2.4.2 料液比的影響

圖2 料液比對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction yield of polysaccharides

如圖2所示，料液比較低時(shí)，多糖得率隨料液比增大而顯著提高，1:45時(shí)達(dá)最高值，隨后多糖得率明顯下降。前者是因?yàn)榻岵煌耆笳呖赡芤驗(yàn)榧铀窟^(guò)大，后續(xù)操作能耗增加，效率降低,也可能是多糖量和醇沉體積分?jǐn)?shù)相同的情況下，水含量過(guò)高使得多糖難以沉淀所致。

2.4.3 超聲功率的影響

圖3 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of polysaccharides

如圖3所示，多糖得率隨超聲功率的增加而顯著增加，至240W時(shí)達(dá)最高值，隨后多糖得率逐漸下降。這可能是因?yàn)殡S超聲功率的增大，細(xì)胞的破碎作用增大，溶解的雜質(zhì)量也相應(yīng)增加，從而使多糖的溶解量減少，也可能是功率過(guò)大引起部分多糖降解。

2.4.4 超聲時(shí)間的影響

圖4 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of polysaccharides

如圖4所示：多糖得率隨超聲時(shí)間的增加而增加，至35min時(shí)達(dá)最高值，隨后多糖得率緩慢下降。這可能是因?yàn)殡S超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞破裂越來(lái)越完全，胞內(nèi)雜質(zhì)進(jìn)入提取液，從而使多糖的溶解量減少，也可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，大分子多糖斷裂，損失。

2.5 天山花楸果實(shí)多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以95%乙醇進(jìn)行醇沉操作，選取料液比、超聲時(shí)間、超聲功率為考察因素，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2、3。

表2 天山花楸果實(shí)多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 The experimental scheme and results of orthogonal array design for optimizing polysaccharide extraction

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

由表2、3可知，天山花楸果實(shí)多糖提取的最佳工藝條件為95%乙醇溶液進(jìn)行醇沉操作，料液比1:45(g/mL)、超聲時(shí)間45min、超聲功率240W。最佳條件實(shí)驗(yàn)證明此時(shí)天山花楸果實(shí)多糖的得率5.92%，比含量測(cè)定部分(4.63%)高出了1.31%。其中影響多糖得率的因素的主次順序?yàn)榱弦罕龋境晻r(shí)間＞超聲功率。料液比對(duì)多糖得率有顯著性影響(F0.05(2,2)=19.00)，對(duì)實(shí)驗(yàn)起主要影響作用。

3 結(jié) 論

天山花楸不同部位的多糖含量差異較大，果實(shí)中含量最高，為4.63%，而根、莖、葉中含量明顯低于果實(shí)中，最低的根含量?jī)H為0.89%。

天山花楸果實(shí)多糖提取的最佳工藝條件為95%乙醇溶液進(jìn)行醇沉操作，料液比1:45(g/mL)、超聲時(shí)間45min、超聲功率240W。最佳條件實(shí)驗(yàn)證明此時(shí)天山花楸果實(shí)多糖的得率5.92%，比含量測(cè)定部分(4.63%)高出了1.31%。其中影響多糖得率的因素的主次順序?yàn)榱弦罕龋境晻r(shí)間＞超聲功率。料液比對(duì)多糖得率有顯著性影響(F0.05(2,2)=19.00)，對(duì)實(shí)驗(yàn)起主要影響作用。

綜上所述，天山花楸果實(shí)中含糖量最高，為4.63%。當(dāng)以95%乙醇溶液醇沉、料液比1:45(g/mL)、超聲時(shí)間45min、超聲功率240W為最佳工藝條件時(shí)，天山花楸果實(shí)中多糖含量為5.92%，其中，料液比是影響天山花楸多糖得率的顯著性因素。

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Optimizing Polysaccharide Extraction from Sorbus tianschanica Rupr. Fruits

Nuramina ABDURSUL，YAN Wen，BAI Jie，Patigul MAHMUT*
(College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

The purpose of this study was to optimize the extraction of polysaccharides from the fruits of Sorbus tianschanica Rupr.. Polysaccharide contents of different parts of Sorbus tianschanica Rupr. including roots, stems, leaves and fruits were assayed spectrometrically, followed by optimizing conditions for the extraction of polysaccharides from the fruits of Sorbus tianschanica Rupr. by orthogonal array design method. The fruits of the plant showed the highest polysaccharide content (4.63%) among the four parts. The optimized extraction conditions were using distilled water as the extraction solvent at a material/liquid ratio of 1:45 for 45 min extraction with the assistance of 240 W ultrasonic treatment. Under these conditions, the highest extraction yield of polysaccharides from the fruits of Sorbus tianschanica Rupr. could reach 5.92%. Moreover, material/liquid ratio was found to be the most significant factor affecting polysaccharide extraction.

Sorbus tianschanica Rupr.；polysaccharide；extraction technology

TQ929.2

A

1002-6630(2011)10-0066-04

2010-08-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30550001)

努爾阿米娜·阿布都肉蘇(1986—)，女，碩士研究生，主要從事植物有效成分研究。

E-mail：nuramina@126.com

*通信作者：帕提古麗·馬合木提(1959—)，女，教授，本科，主要從事植物有效成分研究。

E-mail：patigulimahemuti@126.com