p38MAPK在低能 ESW和間歇 rhPTH1-34促進 ROB成骨的信號轉導中的作用

王 李,劉長劍,羅宗鍵

(1.大連市友誼醫院醫學影像科,遼寧 大連 116001;2.大連醫科大學附屬第一醫院骨科,遼寧 大連 116011;3.長春中醫藥大學附屬醫院 骨科,吉林長春 130021)

p38MAPK在低能 ESW和間歇 rhPTH1-34促進 ROB成骨的信號轉導中的作用

王 李1,劉長劍2,羅宗鍵3

(1.大連市友誼醫院醫學影像科,遼寧 大連 116001;2.大連醫科大學附屬第一醫院骨科,遼寧 大連 116011;3.長春中醫藥大學附屬醫院 骨科,吉林長春 130021)

[目的]探討低能體外沖擊波(ESW)和間歇人重組甲狀旁腺素(rhPTH 1-34)刺激引起的體外培養大鼠成骨細胞(ROB)成骨的細胞內信號轉導中 p38MAPK的作用。[方法]分別用有效的低能ESW刺激和間歇 rhPTH 1-34作用于 ROB,并設立加入 p 38MAPK抑制劑 SB203580組,來觀察 ROB增殖、成骨指標及 Western Blot檢測的p38MAPK磷酸化激活變化。[結果]p38MAPK抑制劑 SB203580能明顯抑制 120次 0.18m J/mm2ESW刺激引起的ROB細胞增殖和成骨作用(P＜0.05);但不能明顯抑制 10-11mol/L間歇rhPTH 1-34刺激引起的體外培養 ROB細胞增殖及成骨作用(P＞0.05)。ESW應力刺激可促進 p-p38MAPK表達,但間歇 rhPTH 1-34不能促進 pp38MAPK表達。[結論]適當的ESW應力刺激可通過激活p 38MAPK促進體外培養ROB增殖和成骨;但p38MAPK并不參與 10-11mol/L間歇 rhPTH 1-34刺激引起的 ROB細胞增殖和成骨的細胞信號轉導。

成骨細胞;體外沖擊波;rhPTH 1-34;p38MAPK

現已知多種理化因素能參與影響體內、外成骨過程的各個環節,各種因素在此過程中并非只是單獨調節骨形成或骨吸收,而是對骨吸收和骨形成在不同的組織、不同的時間段起不同的作用,經綜合、交叉作用后共同完成對成骨的調節。體外沖擊波(extracorporeal shock wave,ESW)和甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)對成骨細胞的作用引人注目。ESW可以一種機械能的形式進入骨折部位,骨組織對高頻率、低強度的機械刺激敏感,而低能量的 ESW正好可持續給予骨折部位的骨組織這種應力刺激;大量研究證明,頻率、能量強度適合的 ESW可促進骨愈合[1,2]。PTH是成骨調節的重要因素,連續給予較高劑量 PTH可使實驗動物破骨細胞數量和活性增加,促進骨吸收;而周期性低劑量給予PTH可使動物活體成骨作用增加[3,4]。但是,ESW和PTH作用的信號機制并不清楚。研究表明,p38MAPK參與多種細胞增殖分化的細胞信號轉導,本研究對 p38MAPK是否參與 ESW和間歇rhPTH1-34促進體外培養大鼠成骨細胞(ROB)增殖、成骨的信號轉導進行了探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：出生 24 h內 Wistar大鼠乳鼠(大連醫科大學實驗動物中心,雌雄不拘,清潔級)每次取 6只大鼠乳鼠顱骨消化分離成骨細胞,分瓶培養、擴增進行實驗。

1.1.2 試 劑：PI染液、RNA酶(北京鼎國生物技術公司),ALP活性檢測試劑盒(南京建成公司),高糖 DMEM培養基(美國 Hyclone公司),胎牛血清(杭州四季青公司),SB203580(美國 sigma生物),細胞全蛋白提取試劑盒(凱基生物),蛋白定量試劑盒(凱基生物),磷酸化 P38 MAPK一抗(美國 Santa Cruze生物),ECL放射顯影試劑盒(美國 Amershan生物),其它試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器和設備：體外沖擊波碎石機(MODELKDE-2001A,北京中科建安公司),流式細胞儀(B.D.FACSAria,美國 B.D.公司),恒溫二氧化碳培養箱(SeriesⅡ Waterern Jacketed CO2Incubator,美國 Thermo Electron公司),超凈工作臺 (Forma ClassⅡ A2 Biological Safety Cabinet,美國 Thermo E-lectron公司),立式滅菌器 (LMQ.R-4060,山東新華醫療儀器公司),Western Blot放射顯影曝光暗室及洗片機,電泳儀(EC120 Mini Vertical Gel System,美國 Thermo Electron)。

1.2 實驗方法

細胞培養,參見作者以前報道的方法[5]。簡要程序如下：取出生 24 h內 Wistar大鼠乳鼠,浸泡于75%酒精中 5～10min,在超凈工作臺中取出顱骨,仔細刮除表面附著的軟組織,剔除骨縫之間軟骨,用128 U/mL慶大霉素浸泡沖洗骨塊 3次,用 DHank's液沖洗 2次,至骨塊發白透亮,置于另一無菌平皿中;用 0.1%I型膠原酶覆蓋骨塊,消化 20 min,吸棄上清及消化掉的細胞,用眼科手術剪將骨塊剪碎至 1 mm3甚至更小,加入 0.1%I型膠原酶消化 30m in,透過紗布吸取消化液,移至裝有 DMEM的離心管中終止消化,再次加入 0.1%I型膠原酶消化 30 min,重復消化共 3次。將獲得的細胞用 DHank's液洗 2次,懸浮于含 10%胎牛血清的DMEM中,調整細胞濃度至 104～105個 /m L,接種于中培養瓶中(視細胞數目一般可接種 2～3瓶),置 5%CO2、37℃培養箱中培養,3～5 d換液,細胞長致融合狀態時消化傳代(1∶2)。

1.2.1 刺激方式及分組：取體外培養第 3代 ROB,刺激之前將 ROB培養于不含血清的培養基中 24 h,使培養的細胞同步化,然后更換含去類固醇血清的培養基。

10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激方式：在每24 h的前 8 h刺激,共循環 2個 24 h。ESW刺激方式：將 MODEL KDE-2001體外液波碎石機調整形成能量密度為 0.18m J/mm2的低能沖擊波。將目標細胞裝入細胞凍干瓶中,然后通過 C型臂 X射線透視裝置將凍干瓶定位在半橢圓形的第 2焦點處,用該能量的沖擊波分別作用含有 ROB細胞懸液(5×105/m L)的細胞凍存管 120次(劑量參照作者前部分實驗已經發表的論文)[5],每組設 3個樣本。

分組：

1.2.2 MTT(噻唑蘭)法檢測細胞增殖：分組刺激后,將細胞培養于含 10%去類固醇 FBS的高糖DMEM中 48 h;然后將培養液棄去,每孔加入 MTT應用液 20μL,繼續培養 4 h,每孔加入 150μL二甲基亞砜(DMSO)孵育 20 min。調整酶標儀波長為490 nm,測定每孔吸光度。

1.2.3 流式細胞術(FCM)進行 DNA倍體分析檢測ROB增殖指數：取第 3代成骨細胞,分組刺激后,培養于含 10%去類固醇 FBS的高糖 DMEM中 24 h。收集細胞,離心棄培養液,70%乙醇固定,置 4℃冰箱過夜。檢測前加 RNA酶溶解 RNA,加 PI染液,避光孵育 30 min,按試劑盒說明上機檢測。用 Modfit分析軟件分析圖像,得出處于各個細胞周期的細胞比例,計算 ROB細胞增殖指數(PI指數)：PI=S%+G2%。

1.2.4 酶標儀檢測 ROB細胞內 ALP活性：分組刺激,將細胞懸浮于含 10%去類固醇 FBS的高糖DMEM中,調整細胞濃度為 2×104/mL,加入 96孔板,培養于 37℃、5%CO2和飽和濕度的恒溫培養箱內 72 h。按試劑盒操作步驟處理 96孔板中的細胞,在 405 nm波長下測定各孔的吸光度。按如下公式計算樣品中堿性磷酸酶(ALP)活性：

ALP活性(金氏單位/100 mL)=(測定管吸光度 /標準管吸光度)×0.005×(100/0.05)

1.2.5 Western Blot檢測 p38MAPK磷酸化激活狀態的變化：探討 p38MAPK在 ESW和間歇 rhPTH 1-34促進體外培養大鼠成骨細胞(ROB)成骨的細胞信號轉導中的作用。

1.3 統計學方法

所有數據采用 SPSS13.0統計分析軟件分析。數據均以 mean+SD表示,根據方差齊性與否,組間差異采用 ANOVA方差分析或校正方差分析,組間比較采用 LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MTT法檢測細胞增殖

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH 1-34刺激可顯著增加 A490值(P＜0.01),這種促進作用不能被p38MAPK抑制劑 SB203580所明顯抑制,提示 10-11mol/L間歇 rhPTH 1-34刺激并不通過激活p38MAPK促進 ROB增殖;0.18 mJ/mm2ESW沖擊120次可顯著增加 A490值(P＜0.01),而這種促進作用能被SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進 ROB增殖;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加 A490值(P＜0.01),而這種促進作用能被抑制劑 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK起作用,詳見表 1。

2.2 流式細胞術(FCM)進行 DNA倍體分析檢測ROB增殖指數(PI指數)

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激可顯著增加 FCM檢測到 ROB的 PI值(P＜0.01),這種促進作用不能被 p38MAPK抑制劑 SB203580所明顯抑制,提示 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激并不通過激活 p38MAPK促進 ROB增殖;0.18 mJ/mm2ESW沖擊 120次可顯著增加 ROB的 PI值(P＜0.01),而這種促進作用能被 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進ROB增殖;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加 PI值(P＜0.01),而這種促進作用能被抑制劑 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活p38MAPK起作用,見表 1。

2.3 酶標儀檢測 ROB細胞內 ALP活性

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激可顯著增加 ROB的細胞內 ALP活性(P＜0.01),這種促進作用不能被 p38MAPK抑制劑 SB203580所明顯抑制,提示 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激并不通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨;0.18 mJ/mm2ESW沖擊 120次可顯著增加 ALP活性(P＜0.01),而這種促進作用能被 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加 ALP活性(P＜0.01),而這種促進作用能被抑制劑 SB203580所明顯抑制(P＜0.05),提示 ESW是通過激活p38MAPK起作用,見表 1。

2.4 Western Blot檢測 p38MAPK磷酸化激活狀態

可見 10-11mol/L間歇 rhPTH1-34刺激并不能促進磷酸化激活的 p-p38MAPK表達;0.18 mJ/mm2ESW沖擊 120次可顯著增加 p-p38MAPK表達(P＜0.01),提示 ESW是通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨;同樣,ESW+PTH刺激可顯著增加p-p38MAPK表達(P＜0.01)。見圖 1～3。

表 1 SB203580對 ESW刺激和間歇性rhPTH 1-34(10-11mol/L)刺激對ROB成骨分化的影響Tab 1 Effectof SB 203580 to ESW and rhPTH 1-34 stimulations'affection to ROB

圖1 內參 β-tubulin(54 kD)Fig 1 Exp ression ofβ-tubu lin(54 kD)

圖2 磷酸化p38MAPK(38 kD)Fig 2 Expression of p 38MAPK(38 kD)

圖3 用 Western Blot檢測 p-p 38MAPK表達Fig 3 P-p38MAPK expression detected by WB＊與對照和加入SB 203580組比較,P＜0.01

3 討 論

PTH是參與調節體內成骨的重要因素。常人PTH分泌呈日節律波動,6AM最高,4PM最低,PTH濃度于 1～5×10-12mol/L之間波動。人體內 PTH的分泌遵循兩種時相原則：①PTH分泌量在頻繁活動中,這種濃度特點可以調節血鈣平衡;②PTH分泌狀態高度穩定,每天的分泌次數、分泌量都有一定規律,這一濃度特點有助于維持正常骨量及骨代謝。此兩種時相被某種生理“開關”控制,在需要時會相互轉換,因而不同的 PTH使用方案會有截然不同的影響體內成骨的效果[6]。體內骨質的溶解和重塑是處在一個動態平衡之中,這種動態平衡又依賴于成骨細胞(OB)和破骨細胞(OC)功能之間的平衡。PTH對 OB和 OC功能的平衡調節是非常精細和微妙的,在某一低濃度范圍內,OB和 OC分化和功能處于平衡狀態,所以骨代謝保持平衡;如果 PTH濃度持續升高,OC的重吸收作用繼續增加,而 OB的成骨作用卻相對減弱或消失,結果會導致骨質吸收增加[7-9]。研究表明,高濃度持續 PTH刺激可引起骨質疏松,這種情況可見于甲旁亢所引起的骨質疏松[10];而低劑量間歇 rhPTH1-34刺激卻被證明可促進成骨。本實驗用已經證明可促進 ROB增殖成骨[11]的 10-11mol/L間歇低劑量 rhPTH1-34刺激作用于 ROB,用 p38MAPK抑制劑 SB203580來試圖抑制其促進 ROB成骨的作用,發現 SB203580并不能抑制 10-11mol/L間歇低劑量rhPTH 1-34刺激促進ROB增殖成骨的作用,說明低劑量間歇 rhPTH1-34刺激并非通過激活 p38MAPK促進ROB成骨。

適當的應力刺激可以促進體內、外成骨,因而近來在骨組織工程構建方式上提出應力化、持續灌流構建的概念[12-14]。多個關于 ESW的研究證實,ESW可以使作用部位的流體力學狀態改變并對處于作用范圍中的細胞產生流體剪切應力(FSS)和牽拉作用[15,16];成骨細胞和骨細胞一直被認為是主要的應力感受細胞,實驗表明適當的0.18mJ/mm2ESW刺激可顯著促進ROB增殖和成骨分化。本實驗采用已經證明可明顯促進 ROB成骨的 ESW刺激[11]作用于ROB,并借助p38MAPK抑制劑 SB203580來觀察 ESW是否通過 p38MAPK起作用;發現,SB203580可明顯抑制 ESW促進 ROB增殖成骨的作用,更進一步Western Blot檢測證實了 ESW可促進 ROB中磷酸化激活的 p38MAPK的表達,說明 ESW刺激確實通過激活 p38MAPK促進 ROB成骨。

在人體環境中,成骨細胞處于生理劑量 PTH作用和持續不斷的應力刺激之下,這兩種因素共同作用對 ROB增殖、分化的影響和機制尚不清楚。本研究采用間歇 rhPTH1-34(1×10-11mol/L,每 24 h的前 8 h刺激,連續刺激 2個 24 h)與 0.18 mJ/mm2ESW(120次)刺激共同作用于體外培養的 ROB(為盡量排除血液中其他活性成分的干擾,實驗過程中采用去類固醇血清),結果發現,rhPTH 1-34間歇刺激 +0.18 m J/mm2ESW(120次)刺激作用最強,能明顯促進 ROB體外增殖和成骨分化,作用顯著強于 0.18 mJ/mm2ESW(120次)組和 rhPTH1-34(1×10-11mol/L間歇刺激);這也有助于解釋為什么體育鍛煉和低劑量間歇 PTH注射可以促進骨質形成。這種促進作用也可被 p38MAPK抑制劑SB203580所明顯抑制,這也印證了 p38MAPK參與ESW+PTH促進 ROB成骨的作用過程,與前面的結論相印證。

在體內環境中(PTH和應力刺激并存),骨吸收和骨形成保持平衡。如果出現抑制骨形成、促進骨吸收的因素,如甲旁亢造成持續超生理劑量 PTH刺激或者缺乏運動等因素,這一平衡會向骨質吸收傾斜,出現骨質疏松等表現;如果出現促進骨形成、抑制骨吸收的因素,如低劑量間歇 PTH刺激和適當的應力刺激等,這一平衡會向骨質形成傾斜。雖然,低劑量間歇 PTH刺激和適當的應力刺激被觀察到可促進體外培養的 ROB增殖、成骨分化,并且p38MAPK參與 ESW作用的信號轉導,但這些作用的詳細分子機制遠未明了,尚需進一步研究。

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Role of p38MAPK in signal transduction of low density ESW and low dose interm ittent rhPTH1-34′saction on bone form ation of cultured rat osteoblasts

WANG Li1,LIU Chang-jian2,LUO Zong-jian3
(1.DepartmentofMedical Radiology,the Friendship Hospitalof Dalian,Dalian 116001China;2.Orthopedic department,the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011 China;3.Orthopedic department,Affiliated Hospital of Changchun Chinese Medicine University,Changchun 130021 China)

[Objective]To investigate the role of p38MAPK in the signal path way of low density ESW and low dose intermittent rhPTH 1-34 stimu lation′s action on rat osteoblasts.[Methods]After stimulations of 0.18 mJ/mm2ESW and 10-11mol/L intermittent rhPTH 1-34,the specific inhibitor of p38MAPK was added for finding the roleof p 38MAPK in the intracellular signal path way.The rat osteoblasts were collected,and cu ltured was detected,p roliferation of these cells was observed by MTT and bone formation bymeasuring ALP activity.The exp ression of p-p38MAPK was detected by Western blot.[Results]Enhaning effect on bone formation by ESW can be significantly inhibited by SB203580,a inhibitor of p38MAPK(P＜0.05).But the enhancement of ROBs'bone formation by intermittent rhPTH 1-34 can not be inhibited by SB203580.Suitable ESW stimulation can improve the expression ofp38MAPK,but intermittent rhPTH 1-34 stimulation can not.[Conclusions]Suitable ESW stimulation can enhance bone formation of ROB by activation of p 38MAPK.The enhancement of ROBs'bone formation by intermittent rhPTH 1-34 stimulation dosen't depend on activation of p38MAPK.

osteoblast;extracorporeal shock wave(ESW);rhPTH 1-34;p38MAPK

R 336

A

1671-7295(2011)01-0031-05

2010-11-25;

2010-12-08

王 李(1975-),女,遼寧大連人,主治醫師,碩士。 E-mail：childliu@sohu.com

劉長劍,主治醫師,博士。E-mail：child.liu@yahoo.com.cn