羥基自由基的光度法分析研究進展

于 露 (荊州市環境保護局,湖北荊州434000)

李凡修 (長江大學化學與環境工程學院,湖北荊州434023)

1 分光光度法

2)甲苯胺藍光度法 何戰勝等[5]研究發現羥自由基可與甲苯胺藍發生氧化反應,且在612nm處羥自由基對甲苯胺藍溶液具有強烈的褪色作用,能使甲苯胺藍的吸光發生變化,提出了間接檢測Fenton反應中羥自由基濃度的新方法。研究發現,最佳測定條件為pH=4.0。該法穩定性好,操作簡便,測定快速,是篩選抗羥自由基的清除劑和有效抗氧化劑藥物的簡便方法。

4)丁基羅丹明B法 丁基羅丹明B無論在酸性介質中,還是在堿性介質中均顯紅色,但在稀硫酸介質中,羥自由基與丁基羅丹明B發生反應,使丁基羅丹明B褪色。翟繼英[7,8]在722型分光光度計480～620nm范圍內測定丁基羅丹明B的吸光度,發現最大吸收波長在554nm處,因此可利用722型光度計上554nm處吸光度的變化,間接測定羥自由基的生成量。

6)萃取-催化氧化光度法 稀土元素的氧化物溶液能催化過氧化氫產生羥基自由基(OH),OH可氧化二苯基碳酰肼生成紅色二苯基碳酰腙,經CHCl3萃取后,其萃取液在最大吸收波長563nm處,ΔA563與過氧化氫、稀土的量呈量效關系。劉德啟[14]利用上述原理建立萃取-催化氧化光度法測定H2O2的羥基自由基的新方法。在好氧生物體過氧化氫含量的實際水平范圍內,該法在離體篩選抗氧劑方面更接近生物體過氧化氫含量的水平,比Fenton試劑要靈敏的多。該法具有儀器簡單、體系穩定、操作方便等優點,非常適合于篩選羥基自由基消除劑。

另外利用Fenton反應產生的羥基自由基與染料試劑溴甲酚綠 (Bromocresol green,B G)[15]、溴鄰苯三酚紅、桑色素等發生氧化反應后使其吸光度值降低,都可建立間接測定羥基自由基的方法[8]。賈之慎等用水揚酸捕獲OH后,與Na2WO4和NaNO2顯色,510nm比色測定,間接測定羥自由基含量。徐向榮等[9]用DMSO捕獲OH形成甲基亞磺酸,在420nm比色測定Fe2+-H2O2體系產生的OH,上述方法均可用于羥自由基清除劑的篩選。

2 熒光光度法

1)苯基熒光酮熒光法 苯基熒光酮 (Phenylfluorone,簡稱本芴酮)與Fenton試劑作用后,可使其熒光大大降低,其最大激發波長和發射波長分別500nm和420nm,基于苯基熒光酮在反應前后的熒光變化,吳南等建立了一種新的可間接地測定羥自由基方法,并通過順磁共振法測定苯基熒光酮加入前后的波譜變化來進一步證實該方法的正確性。該方法具有較高的靈敏度,可作為尋找羥自由基清除劑的方法,也可作為醫學上部分藥品性能檢驗的有效方法。

在此基礎上,任風蓮等[16]提出了一種快速、簡便地測定Sn(Ⅱ)-H2O2體系產生羥自由基 (OH)的新方法。由于Sn2+可與H2O2作用發生類似Fenton反應,產生大量羥自由基,采用苯基熒光酮phenylfluorone作為Sn(Ⅱ)-H2O2反應體系的熒光試劑,再利用其產生的羥自由基氧化苯基熒光酮,使苯基熒光酮的強度發生變化,可間接地測定羥自由基的產生量。苯基熒光酮熒光法對儀器要求低,方法簡便,操作易行,選擇性好,準確可靠,是一種值得推廣的新型測定羥自由基的有效方法,特別適用于檢測離體體系中羥自由基的氧化效應及其清除羥自由基的機理研究。

2)吡啶熒光法 谷學新等[17]利用羥基自由基氧化二甲亞砜 (DMSO)生成的甲醛與乙酰丙酮、氨發生Hantzsch反應,其產物3,5-二乙酰-1,4-二氫吡啶可產生特征熒光,其最大激發波長和最大發射波長分別為419.4nm和505.5nm,通過測定熒光強度的變化可間接定量羥基自由基的產生量。該方法簡便可靠,不需昂貴儀器,操作簡便,易于被一般實驗室采用,對于抗氧化劑的篩選以及羥基自由基的機理研究具有一定的應用價值。

3)楊基熒光酮熒光法 水楊基熒光酮 (salicylfluorone,SAF)是一種多羥基芳香酮,由于具有多羥基及較好的剛性平面結構,它本身就能產生熒光,因此任何改變其結構的變化都能改變它的熒光。基于以上原理,Fenton試劑產生的羥自由基與水楊基熒光酮SAF作用后,可生成另外一種熒光物質,從而發生了熒光的變化,可利用熒光強度變化來間接測定所產生的羥自由基[18]。

任鳳蓮[19]實驗中發現Co2+與H2O2反應生成羥自由基的產率比Fenton試劑的高100倍以上,從而建立水楊基熒光酮 (SAF)-CoⅡ-H2O2熒光法測定羥自由基的新體系,其激發波長和發射波長分別為510nm和500nm,利用該測定體系在反應前后的熒光變化,可間接測定羥自由基產生量。該法不需昂貴的儀器設備,方法靈敏,操作簡單易行。清除率實驗及ESR波譜法檢測均證明了該方法的準確可靠,對于醫用篩選抗羥自由基藥物及抗羥自由基機理研究等方面具有應用價值。

4)Ce3+熒光法 徐向榮等[20,21]利用Ce3+在稀硫酸中能產生特征熒光,其最大激發波長OH和發射波長分別為280nm和360nm。利用Fenton反應或Sn2+與H2O2作用能將Ce3+氧化成無熒光Ce4+,通過測定Ce3+的熒光強度變化可間接測定羥基自由基的產生量。該法儀器簡單,操作簡便,測定快速,適于羥自由基的在線測定和監控。

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