CCN蛋白的功能與機制

鮑艷芳 應素芬 何斐 泮瑛瑛 張偉 徐靈芝

近來研究發現細胞外基質（ECM）并不只是細胞的支架，它還能動態調節各種細胞的功能和行為。ECM能結合生長因子、細胞因子、化學因子和細胞外酶，并調節它們的生物利用度和活性。此外，ECM蛋白可以直接和細胞表面受體作用，激發信號通路，從而調節各種細胞功能。ECM蛋白中有一種基質細胞蛋白（matricellular proteins），呈動態表達，但無明顯的結構作用，主要調節細胞對環境刺激的反應。已知的基質細胞蛋白有血小板反應蛋白（thrombospondins），富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）、hevin、骨橋蛋白（osteopontin）、結合腕蛋白（tenascin）C和X以及CCN家族成員。最近研究顯示，CCN蛋白是胚胎發育所必需的調節因子，并在炎癥、創傷修復、纖維性疾病和腫瘤中有重要作用。

最早發現的3個成員分別是CYR61、CTGF和NOV。由于CCN蛋白有很多名字，為減少不同名稱造成的混亂，國際上按最早發現的3個成員的首字母縮寫將其命名為CCN1-6。他們是脊椎動物中富含半胱氨酸的6個同源蛋白，有共同的結構模式，氨基端分泌肽后面緊接著4個保守的結構域，序列上分別和胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）、von Willebrand因子C型重復（vWC）、血小板反應蛋白I型重復（TSP）和含半胱氨酸結基序的羧基末端結構域（CT）相似。每個結構模塊都是由保守的獨立外顯子編碼，提示CCN基因是外顯子改組的產物。蛋白中間有一個鉸鏈結構，對蛋白水解特別敏感[1]。可能由于半胱氨酸殘基含量很高(0～10%)，目前很難提取有生物活性的純CCN蛋白。難以獲得高質量的純CCN蛋白以及對其生物活性和功能評價缺乏一個統一標準是阻礙研究進展的重要原因。由于蛋白制備方法不同，各個實驗室結果可能存在不一致。對CCN功能的研究使得人們對ECM功能有更多的認識。

1 CCN蛋白的細胞受體和其調控的細胞功能

1.1 CCN蛋白的細胞受體

關于CCN蛋白的細胞受體目前比較明確的觀點有：（1）CCN蛋白主要和包括整合素、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)在內的細胞粘附受體結合而發揮作用。目前發現介導CCN功能的整合素至少包括α2β1、α5β1、α6β1、αvβ5、αIIbβ3、αMβ2和αDβ2。在某些條件下HSPGs作為整合素的輔助受體，與CCN之間也有強相互作用。（2）脂蛋白受體相關蛋白(LRPs)等一般情況下不和ECM蛋白結合的受體也能和CCN結合。（3）CCN和不同的整合素結合取決于目標細胞類型和介導的功能。（4）CCN蛋白上不同的整合素結合位點既可以相互協同，又可以獨立完成不同的細胞效應。

1.2 細胞粘附、遷移和DNA合成

作為細胞粘附蛋白是CCN家族最顯著和一致的功能。細胞在體外培養時貼壁生長，CCN蛋白和整合素以及與HSPGs結合啟動粘附信號通路從而支持大多數粘附細胞的粘附。CCN蛋白還能作為橋接蛋白促進細胞粘附到其他ECM蛋白。CCN蛋白的另外一個獨特功能是調節細胞遷移。CCN1、CCN2和CCN3蛋白可以促進很多干細胞遷移，但是過表達的CCN4和CCN5卻抑制細胞遷移。CCN1、CCN2及CCN3都是微血管內皮細胞的化學趨化劑，這點與它們促血管生成作用是一致的。CCN2還有化學激動劑的作用。

CCN蛋白促有絲分裂的作用似乎取決于細胞類型。盡管CCN2能促進軟骨細胞和成骨細胞的DNA合成[2]，但它是否能促進纖維母細胞的有絲分裂還是有爭議的。早期研究認為CCN2能促進纖維母細胞的有絲分裂，然而其他研究顯示CCN1、CCN2和CCN3單獨作用時本身沒有促進有絲分裂的能力，但是可以通過整合素αvβ3增強其他促有絲分裂生長因子的DNA合成作用。與此相反的是CCN5缺乏CT結構域，它的作用是抑制細胞增殖。

1.3 細胞生存和凋亡

很多細胞粘附到ECM會促進其生存，而脫離ECM則很快發生細胞死亡。因此CCN蛋白和不同細胞及不同整合素作用，既能促進細胞生存又能誘導凋亡，提示其可能在組織塑形中發揮作用。

1.4 血管發生

CCN1、CCN2和CCN3直接和整合素αvβ3結合促進內皮細胞粘附、遷移、增生和小管形成從而促進血管生成。CCN1促進整合素依賴的CD34+前體細胞招募而增強內皮細胞的增生和新生血管生成[3]，與此一致的是CCN1敲除小鼠有心臟缺陷。除了直接作用，CCN還能調節VEGF-A、VEGF-C等促血管生成因子的表達和活性[1]。CCN蛋白在胚胎發育、炎癥和腫瘤發生中有重要作用，可能部分和其促血管生成作用有關[4]。

1.5 軟骨和骨發生

動物模型和細胞培養實驗顯示CCN蛋白對骨形成有正負雙向調節作用。CCN1促進成骨細胞分化抑制破骨細胞，提示在骨發生上有雙向調節作用[5]。體外培養中CCN2可以促進原代成骨細胞的增殖和分化，小鼠實驗中CCN2過表達則抑制成骨細胞功能從而導致骨質疏松[6]。

1.6 CCN蛋白和生長因子及細胞因子之間的相互作用及功能

通過功能性和/或物理性相互作用，CCN蛋白可以改變某些生長因子和細胞因子的作用。CCN蛋白可以改變TNFα在炎癥反應中的作用。CCN1生物效應的發揮需多種受體參與，細胞上的受體可能決定了哪些細胞將被清除。CCN蛋白也可以調節生長因子的生物利用度和信號通路。CCN能促進和增強TGF-β功能，卻抑制BMP的功能。

1.7 生長因子、激素和環境刺激調節CCN基因表達

CCN基因的表達受到各種環境刺激的影響，包括生長因子、激素、細胞因子、缺氧、UV和機械應力。這些基因對許多促有絲分裂信號和外部刺激高度敏感，包括成纖維生長因子、血小板衍化生長因子、佛波醇酯類和cAMP。TGF-β能強烈調控CCN基因表達，包括激活CCN1、CCN2、CCN4和CCN5的轉錄，抑制CCN3的表達。最近報道了一個新的調控機制，軟骨細胞中基質金屬酶MMP3和一個CCN2增強子結合能增強其表達，可能是通過轉錄子起作用[7]。MMP3在細胞內協同TGF-β激活CCN2啟動子，提示MMP3和SMAD信號通路之間有相互作用。

一些激素也上調CCN表達。體外實驗中血管緊張素Ⅱ增強VSMCs或鼠主動脈中CCN1的表達(Hilfiker et al，2002)。內皮素能上調成纖維細胞、VSMCs和心肌細胞CCN2的表達，與他們在纖維化疾病和心肌中的功能一致。CCN基因對環境刺激很敏感。暴露到紫外線下就可以誘導CCN1表達。低氧條件下在缺氧誘導因子1α(HIF-1α)作用下可以誘導CCN和CCN2表達。HIF-1α和c-Jun/AP-1作用從而有助于CCN1在缺氧條件下的轉錄。對于CCN2，HIF-1α依賴的轉錄和通過3′UTR的一個序列元件增強mRNA穩定性均有利于缺氧狀態下的CCN2的表達。機械刺激也能誘導CCN基因表達。成纖維細胞，軟骨細胞和VSMCs在張力和壓力作用下，內皮細胞在血流動力作用下，腎小球系膜細胞在靜水壓作用下均能快速表達CCN1和CCN2。應力能上調心肌和骨骼肌中CCN1和CCN2的表達[8]。在人體研究中發現，一次強力鍛煉后機械應力能誘導骨骼肌表達CCN1和CCN2[8]。炎癥和組織損傷也能誘導CCN表達。在出生后的發育和正常人體組織中，CCN蛋白通常都是低水平表達的，但是在炎癥和損傷修復中表達升高。IL-1和TNFα等炎癥細胞因子誘導CCN表達[9]，細菌和病毒感染也能誘導其表達[10]。

1.8 CCN蛋白在胚胎發育中的作用

敲除CCN1、CCN2、CCN3和CCN6等目標基因的小鼠模型都已經建立。除了CCN6敲除小鼠沒有明顯表型改變外，其他敲除小鼠的表型改變說明CCN在心血管和骨骼發育中有重要作用。敲除CCN1的小鼠在胚胎發育中出現致命的心血管畸形。CCN1敲除小鼠在發育的早期就死亡了，盡管胚胎死亡時還沒明顯的骨骼異常但無法準確判斷胚胎晚期CCN1是否影響骨骼發育。CCN1和CCN2在活性和表達模式上有很多相似之處。盡管有相似之處，但在小鼠中分別敲除CCN1和CCN2后，卻表現出了完全不同的表型。CCN1主要導致心血管系統異常，CCN2則主要導致呼吸系統畸形，以及嚴重的骨骼畸形。已經成功構建了敲除CCN3的小鼠，它們中也發現了CCN1和CCN2敲除小鼠中出現的缺陷，包括四肢和中軸骨缺陷、嚴重的關節畸形、心內膜墊重塑形異常伴心臟隔缺損。CCN3突變小鼠的晶狀體中發現未成熟組織的退變，6個月以上的成年小鼠出現白內障。到目前為止基因敲除的小鼠中尚未發現神經系統表型異常，因此CCN蛋白對神經元細胞或神經系統發育的作用至今未知。

2 CCN蛋白在組織修復及其他疾病中的作用

2.1 傷口愈合

CCN蛋白參與很多組織的修復。在損傷修復早期，從血小板的α顆粒中釋放出大量CCN2蛋白。CCN1和CCN2能直接與整合素αIIbβ3結合，支持血小板的粘附，并作為單核細胞等炎癥細胞的粘附底物。在損傷修復晚期即組織塑形過程，CCN蛋白也是高表達的。此時CCN蛋白協同TGF-β對基質塑形，并可能與TNFα作用而觸發纖維母細胞的凋亡[11]。長骨骨折時，骨痂中CCN1和CCN2的表達增加，這在增殖的軟骨細胞和成骨細胞中尤其明顯。抗體阻斷CCN1后能抑制小鼠骨折的愈合[12]，鼠關節炎模型中重組的CCN2蛋白能促進關節軟骨的修復。這些研究提示CCN蛋白在骨和軟骨的修復中可能發揮重要作用。

2.2 CCN與纖維化疾病

CCN2過表達和各種器官的纖維化有緊密聯系。在皮下單獨注射TGF-β或CCN2只能短暫誘導肉芽組織生成，而聯合應用TGF-β和CCN2則產生持續的纖維化反應。推測認為TGF-β只是啟動纖維化反應，CCN2則協同并增強TGF-β的作用。CCN2在肝臟纖維化和系統性硬化中有重要作用。用小干擾RNA敲除CCN2后可以阻止CCl4誘導的鼠肝臟纖維化[13]。肝硬化和纖維化的動物模型和病人中均發現纖維間隔中星狀細胞的CCN2表達升高。在體外，CCN2支持肝臟星狀細胞和橢圓形細胞的粘附，刺激星狀細胞增殖和橢圓形細胞的遷移[14]。此外，在系統性硬化或硬皮病中CCN2是顯著高表達的。人CCN2蛋白啟動子的多態性和硬皮病顯著相關[15]。這些研究結果強調了CCN2在纖維化中的重要作用，提示CCN2可能是抗纖維化的潛在治療靶點[16]。

2.3 糖尿病腎病

小鼠足細胞CCN2過表達會加重糖尿病腎病提示CCN2在此疾病中有重要作用[17]，而用反義寡核苷酸減少CCN2的表達能減輕腎臟纖維化及減輕糖尿病小鼠的腎病[18]。在體外，CCN2促進腎小球系膜細胞的存活，刺激基質沉積，抑制高糖對基質的退變作用。近來一些獨立研究顯示血漿或腎臟中的CCN2水平是糖尿病腎病的一個有用指標[19-20]。

2.4 血管疾病

CCN1和CCN2在動脈粥樣硬化灶的VSMC和球囊血管成形術后再狹窄病灶中過表達。用小干擾RNA或FOXO3a抑制CCN1表達可以減少球囊血管成形術后新生內膜增生，用轉基因技術再次增加CCN1表達可以逆轉此結果[21-22]。這些結果強調CCN1在血管修復方面的重要作用，提示抑制CCN1可能可以預防血管手術后的再狹窄[22]。

2.5 腫瘤

大量的研究工作支持以下觀察：（1）很多組織來源的腫瘤都有CCN的異常表達。（2）CCN基因的異常表達對腫瘤有促進或抑制作用，取決于腫瘤類型。（3）在有些腫瘤中，抗CCN治療可以抑制腫瘤的生長或轉移。（4）CCN基因表達情況可以作為很多腫瘤的診斷或預后指標[22-24]。

CCN促進腫瘤生長的一個可能機制是促進腫瘤血管生成。CCN促進腫瘤生長的另外一個機制是增強腫瘤細胞的生存能力。矛盾的是，CCN蛋白也可以抑制腫瘤的生長。例如，CCN1抑制裸鼠中非小細胞肺癌的生長。CCN2通過CRMP-1依賴方式抑制肺腺癌的轉移和侵襲，抑制結腸直腸的腫瘤的轉移。能調節IGF信號的CCN6能抑制炎性乳腺癌的生長[24]。

CCN蛋白的抗血管和凋亡活性方便可以促進或抑制腫瘤生長，CCN蛋白在腫瘤中的作用是復雜的，可能涉及多個下游效應器。理解CCN蛋白如何促進或抑制腫瘤生長還需要進一步的研究。雖然如此，各種腫瘤中和CCN蛋白之間存在很強的相關性提示此蛋白是一個有價值的預后因子，CCN信號通路可能是一個新的抗腫瘤靶點。

3 結論和展望

目前認為CCN家族蛋白是一個和發育及損傷修復有關的ECM相關性多功能調節因子。在細胞水平，CCN蛋白直接與整合素結合發揮作用，有些情況下需HSPGs和LRPs起協同受體作用。CCN調節細胞粘附、遷移、增殖、分化、凋亡、生存。此外，他們還與包括TGF-β、TNFα、VEGF、BMPs，及Wnt家族成員在內的生長因子和細胞因子相互作用并調節它們的生物利用度和（或）活性，從而具有廣泛的作用。CCN蛋白是血管生成和軟骨發育的有力調節因子，在損傷修復、纖維疾病和腫瘤中也發揮重要作用。最近研究強調他們作為細胞粘附分子既能促進細胞死亡又能促進細胞存活，還能復雜地調節TNFα等炎癥細胞因子的細胞毒性作用。盡管已知在生理條件下CCN1可以調節TNFα，CCN蛋白在炎癥中的作用還沒有得到徹底的研究；盡管CCN蛋白的功能性結構域已經被描繪出來了，而且一些特定整合素結合部位已經被確定，但它的三維結構仍然不清楚。CCN蛋白中半胱氨酸殘基含量異乎尋常地高，提示這可能是一個明顯影響其功能的結構。

到目前為止基因打靶研究確定了CCN蛋白在心血管和骨骼發育中的關鍵作用。但是由于小鼠敲除CCN1或CCN2后在胚胎發育期或出生前后就死亡了，因而無法得知它們在發育晚期及疾病過程中的作用。因此，在特定組織或一定條件下消除CCN基因才能揭示它們在特定器官和組織中的作用。此外用突變的等位基因替換正常的CCN基因，從而消除CCN與特定受體或蛋白的結合能力的等位基因置換法可能可以說明CCN。

[1]Dean RA, Butler GS, Hamma-Kourbali Y, et al.Identification of candidate angiogenic inhibitors processed by matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) in cell-based proteomic screens: disruption of vascular endothelial growth factor (VEGF)/heparin affine regulatory peptide (pleiotrophin) and VEGF/Connective tissue growth factor angiogenic inhibitory complexes by MMP-2 proteolysis[J].Mol Cell Biol,2007,27(24): 8454-8465.

[2]Kubota S, Takigawa M.Role of CCN2/CTGF/Hcs24 in bone growth[J].Int Rev Cytol,2007,257: 1-41.

[3]Grote K, Salguero G, Ballmaier M, et al.The angiogenic factor CCN1 promotes adhesion and migration of circulating CD34+ progenitor cells: potential role in angiogenesis and endothelial regeneration[J].Blood,2007,110(3): 877-885.

[4]Kubota S, Takigawa M.CCN family proteins and angiogenesis:from embryo to adulthood[J].Angiogenesis,2007,10(1): 1-11.

[5]Crockett JC, Schutze N, Tosh D, et al.The matricellular protein CYR61 inhibits osteoclastogenesis by a mechanism independent of alphavbeta3 and alphavbeta5[J].Endocrinology,2007,148(12): 5761-5768.

[6]Smerdel-Ramoya A, Zanotti S, Stadmeyer L, et al.Skeletal overexpression of connective tissue growth factor impairs bone formation and causes osteopenia[J].Endocrinology,2008,149(9): 4374.

[7]Eguchi T, Kubota S, Kawata K, et al.Novel transcriptionfactor-like function of human matrix metalloproteinase 3 regulating the CTGF/CCN2 gene[J].Mol Cell Biol,2008,28(7): 2391-2413.

[8]Kivela R, Kyrolainen H, Selanne H, et al.A single bout of exercise with high mechanical loading induces the expression of Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 in human skeletal muscle[J].J Appl Physiol,2007,103(4):1395-1401.

[9]Gashaw I, Stiller S, Boing C, et al.Premenstrual regulation of the pro-angiogenic factor CYR61 in human endometrium[J].Endocrinology,2008,149(5): 2261-2269.

[10]Wiedmaier N, Muller S, Koberle M, et al.Bacteria induce CTGF and CYR61 expression in epithelial cells in a lysophosphatidic acid receptordependent manner[J].Int J Med Microbiol,2008,298(3-4): 231-243.

[11]Chen CC, Young JL, Monzon RI, et al.Cytotoxicity of TNFalpha is regulated by integrin-mediated matrix signaling[J].EMBO J,2007,26(5):1257-1267.

[12]Athanasopoulos AN, Schneider D, Keiper T, et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced up-regulation of CCN1 in osteoblasts mediates proangiogenic activities in endothelial cells and promotes fracture healing[J].J Biol Chem,2007,282(37): 26746-26753.

[13]George J, Tsutsumi M.siRNA-mediated knockdown of connective tissue growth factor prevents N-nitrosodimethylamine-induced hepatic fibrosis in rats[J].Gene Ther,2007,14(10): 790-803.

[14]Pi L, Ding X, Jorgensen M, et al.Connective tissue growth factor with a novel fibronectin binding site promotes cell adhesion and migration during rat oval cell activation[J].Hepatology,2008,47(3): 996-1004.

[15]Fonseca C, Lindahl GE, Ponticos M, et al.A polymorphism in the CTGF promoter region associated with systemic sclerosis[J].N Engl J Med,2007,357(12): 1210-1220.

[16]Leask A.Targeting the TGFbeta, endothelin-1 and CCN2 axis to combat fibrosis in scleroderma[J].Cell Signal,2008,20(8): 1409-1414.

[17]Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, et al.Overexpression of connective tissue growth factor in podocytes worsens diabetic nephropathy in mice[J].Kidney Int,2008,73(4): 446-455.

[18]Guha M, Xu ZG, Tung D, et al.Specific down-regulation of connective tissue growth factor attenuates progression of nephropathy in mouse models of type 1 and type 2 diabetes[J].FASEB J,2007,21(12): 3355-3368.

[19]Jaffa AA, Usinger WR, McHenry MB, et al.Connective tissue growth factor and susceptibility to renal and vascular disease risk in type 1 diabetes[J].J Clin Endocrinol Metab,2008,93(5): 1893-1900.

[20]Thomson SE, McLennan SV, Kirwan PD, et al.Renal connective tissue growth factor correlates with glomerular basement membrane thickness and prospective albuminuria in a non-human primate model of diabetes:possible predictive marker for incipient diabetic nephropathy[J].J Diabetes Complications,2008,22(4): 284-94.

[21]Lee HY, Chung JW, Youn SW, et al.Forkhead transcription factor FOXO3a is a negative regulator of angiogenic immediate early gene CYR61, leading to inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation and neointimal hyperplasia[J].Circ Res,2007,100(3): 372-380.

[22]Matsumae H, Yoshida Y, Ono K, et al.CCN1 knockdown suppresses neointimal hyperplasia in a rat artery balloon injury model[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(6): 1077-1083.

[23]Yeger H, Perbal B.The CCN family of genes: a perspective on CCN biology and therapeutic potential[J].J Cell Commun Signal,2007,1(3-4): 159-164.

[24]Kleer CG, Zhang Y, Merajver SD.CCN6 (WISP3) as a new regulator of the epithelial phenotype in breast cancer[J].Cells Tissues Organs,2007,185(1-3): 95-99.