淺部真菌感染直接鏡檢有關(guān)問題探討

蒙在楊

淺部真菌病是由寄生于皮膚角蛋白組織的致病真菌所引起的皮膚病，包括頭癬、須癬、體股癬、疊瓦癬、手足癬、甲真菌病、花斑癬和馬拉色菌毛囊炎等是皮膚科的常見病和多發(fā)病。直接鏡檢是實(shí)驗(yàn)室診斷皮膚真菌病常用的快速、可靠的方法[1]。通過將鱗屑溶解于氫氧化鉀溶液后直接鏡檢證明損害部位刮取的鱗屑內(nèi)有病原真菌存在。實(shí)際工作中，一些因素使直接鏡檢法檢測(cè)結(jié)果受到影響，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性。現(xiàn)對(duì)操作中出現(xiàn)的一些問題進(jìn)行探討，旨在提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 載液的選取

載液同標(biāo)本反應(yīng)的時(shí)間長(zhǎng)短和使用不同的載液處理標(biāo)本可影響皮屑直接鏡檢的陽性率，在臨床上應(yīng)根據(jù)皮損的角化程度選用不同的載液。

1.1 10% KOH溶液 10%KOH溶液滴加在玻片上，水份隨鏡檢時(shí)間的延長(zhǎng)而揮發(fā)，特別是室內(nèi)溫度高時(shí)，KOH相對(duì)濃度增加，對(duì)皮屑較少的標(biāo)本有時(shí)會(huì)使真菌溶解,造成假陰性。無明顯角化的皮屑鏡檢要及時(shí)完成，因?yàn)楦珊孕纬山Y(jié)晶,不利于形態(tài)辨認(rèn)，造成鏡檢困難。明顯角化的皮屑可延長(zhǎng)鏡檢時(shí)間，因?yàn)?0%KOH溶液對(duì)角質(zhì)溶解效果好。

1.2 10% KOH甘油溶液 10%KOH甘油溶液揮發(fā)緩慢，不易干涸而形成結(jié)晶，可延長(zhǎng)涂片保存時(shí)間并利于檢查，但對(duì)角質(zhì)細(xì)胞溶解所需的時(shí)間較長(zhǎng)。為了便于溶解，需要加熱,如果溫度掌握不當(dāng)可致玻片破裂，甚至載液沸騰蒸發(fā)形成結(jié)晶或造成真菌特征性結(jié)構(gòu)破壞,而增加鏡檢難度。當(dāng)室溫較低時(shí)玻片的余熱與周圍空氣產(chǎn)生細(xì)微水霧而使顯微鏡鏡頭模糊。另外，10%KOH溶液有腐蝕性，溢出容易使顯微鏡載物臺(tái)和聚焦鏡損壞，不加蓋玻片時(shí)當(dāng)操作不當(dāng)使顯微鏡物鏡接觸該溶液受到損傷。無明顯角化的皮屑適合這種載液處理。

1.3 10% KOH二甲基亞砜溶液 在KOH溶液中加入40%二甲基亞砜，其特點(diǎn)可增加在KOH的通透性，加速角質(zhì)細(xì)胞溶解，但放置時(shí)間過長(zhǎng)可能破壞菌絲而出現(xiàn)假陰性。

2 標(biāo)本的取材

取材要準(zhǔn)確、足量包括被病原真菌感染的淺部組織如甲板、毛發(fā)和皮膚以及深部組織。盡量采取新被侵染的組織，如頭癬的斷發(fā)、癬病的邊緣性損害、新鮮的水皰、甲真菌病的甲板深層、皮下真菌病的組織塊和滲液、馬拉色菌毛囊炎的毛囊內(nèi)容物等。常用的取材方法有鈍手術(shù)刀刮取法和膠帶法等兩種。

2.1 鈍手術(shù)刀刮取法 在皮損處直接用鈍手術(shù)刀將鱗屑刮在載玻片上，加入載液或染液后觀察。本法多用于光滑無毛處皮損取材，是臨床上最常用的方法，特別適用鱗屑多者。

2.2 膠帶法 該法常用于花斑癬的取材。用透明兩面膠帶（文具店有售）取材。先將兩面膠帶的一面貼于待檢皮膚，數(shù)分鐘后取下，使非接觸皮膚的膠帶面貼于載玻片上，將與皮膚接觸的那一面朝上并加入染液后觀察。也可在載玻片上預(yù)先帖上兩面膠帶，再將此玻片膠帶面壓在皮損上，幾分鐘后將粘有標(biāo)本的玻片膠帶染色觀察。如果是單面膠帶，應(yīng)該先滴加1滴染液于載玻片，再將貼于皮膚的粘面取下直接蓋在載玻片鏡檢。本法對(duì)皮膚無損傷，無畏懼感，可多處反復(fù)取材，適用于鱗屑少或不宜刮取鱗屑者，利于兒童及不合作者的取材。

使用不同的取材方法影響皮屑直接鏡檢的陽性率，透明膠布粘貼法適用于無明顯角化的皮損取材，尤其是有明顯皮屑但無明顯角化的皮損。銼刀刮取法適用于有明顯角化的皮損取材。

3 標(biāo)本的適當(dāng)處理

對(duì)富含角質(zhì)蛋白的皮屑、毛發(fā)、甲屑等用含10%KOH溶解角質(zhì)蛋白，對(duì)菌量少不易確定的標(biāo)本可滴加復(fù)方派克墨水染液進(jìn)行染色以增加辨認(rèn)度。

4 調(diào)整顯微鏡

首先降低聚光器，調(diào)暗視野，利于突出真菌成分的折光度，其次在低倍鏡下多視野仔細(xì)尋找目標(biāo)，然后轉(zhuǎn)高倍鏡辨認(rèn)形態(tài)。

5 鏡檢

真菌菌絲和孢子具有折光性，標(biāo)本經(jīng)10%KOH溶解后，鏡下呈暗綠色熒光。真菌菌絲和孢子在鏡下特點(diǎn)：圓筒形細(xì)胞沿長(zhǎng)軸方向連接，前端邊分枝邊形成絲狀結(jié)構(gòu)，這就是菌絲；菌絲在一定的間距形成橫隔,叫隔膜，它把菌絲分成一連串的細(xì)胞,有橫隔的菌絲叫有隔菌絲,無橫隔的菌絲叫無隔菌絲；菌絲的發(fā)育點(diǎn)在其前端，邊分枝邊生長(zhǎng),形成網(wǎng)狀、樹枝狀及束狀的集合體，這就是菌絲體。孢子常呈圓形、卵圓形或筒形。標(biāo)本經(jīng)10%KOH溶解后，在被溶解上皮細(xì)胞的輪廓中還可看到一些帶折光性的顆粒，這些顆粒是一些細(xì)胞器，大小與真菌的孢子相當(dāng)，容易被誤判成孢子。角質(zhì)形成細(xì)胞的邊緣不易被溶解，也常被誤看成是菌絲，檢測(cè)者應(yīng)該微調(diào)顯微鏡光線的強(qiáng)弱，如果出現(xiàn)上皮細(xì)胞的輪廓，則可以排除是真菌。此外，背景中的氣泡、纖維絲、脂肪滴等雜質(zhì)也具有一定的折光性，容易被當(dāng)成菌絲或孢子，應(yīng)滴加派克墨水染液進(jìn)行染色，經(jīng)染色后的標(biāo)本鏡下菌絲和孢子被染成藍(lán)色，而背景中的細(xì)胞器、角質(zhì)細(xì)胞、脂滴、氣泡、纖維絲等均不著色，對(duì)比鮮明，便于確認(rèn)。

[1] Difonzo EM, Faggi E. Skin diseases associated with Malassezia species in humans. Clinical features and diagnostic criteria[J]. Parassitologia,2008, 50(1-2): 69-71.