魚類MSTN基因的研究進展

邵芳，盧祥云，顧志良

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500）

魚類MSTN基因的研究進展

邵芳，盧祥云，顧志良

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500）

肌肉生長抑制素（MSTN）屬于轉化生長因子超家族，是主要在骨骼肌中特異性表達且功能比較專一的肌肉發育負調控因子.魚類的MSTN基因比較復雜，具有不同的同源基因.本文綜述了魚類MSTN基因的結構、種類、時空表達特征，MSTN的作用機理及生物學功能，魚類MSTN基因多態性研究以及MSTN基因在魚類生產中潛在的應用前景.

肌肉生長抑制素；同源基因；多態性

魚類在脊椎動物中是種屬數量最占優勢的類群，物種眾多，分布廣泛，起源復雜[1].魚類肌肉的生長、分化是其生長發育過程中的重要環節，受環境、基因和激素水平的調控等多種因素的影響.在基因水平上，與肌肉生長發育及分化有關的基因主要是作為正向調控因子的生肌決定因子（Myogenic regulatory factors，MRFs）和作為負向調控因子的肌肉抑制素基因（Myostatin，MSTN）.肌肉生長抑制素屬于轉化生長因子超家族，是近年來發現的作為主要在骨骼肌中特異性表達且功能比較專一的肌肉發育負調控因子，它通過抑制生肌調節因子（MyoD）家族成員轉錄活性負向控制肌細胞的生長發育，它的表達量與肌肉重量的變化呈負相關[2].在家畜中，MSTN基因的活性喪失可導致肌肉增大，體重增加，因此有關MSTN基因的研究近幾年來一直是十分活躍的研究領域，并已取得了顯著的進展.在魚類MSTN的研究中，對重要養殖魚類進行遺傳改造以控制MSTN基因的表達或生物活性，無疑會給水產養殖業帶來巨大的影響.

1 魚類MSTN基因的結構、種類和表達

1.1 魚類MSTN基因的結構和種類

自從MSTN基因在小鼠中被發現以來，由于具有潛在的應用價值，越來越多物種的MSTN基因被鑒定，魚類的研究也很多.目前已經在斑馬魚（Danio rerio）、虹鱒魚（Oncorhychus mykiss）[3-6]等魚中克隆到了MSTN基因.對這些魚類MSTN基因的研究中可以看出，魚類MSTN均是由3個外顯子和2個內含子組成，外顯子編碼分泌性的N-端信號序列，具有高度的種間多樣性，外顯子2和外顯子3高度保守，編碼前肽和C-端二聚體.不同物種外顯子長度相差不大，但是內含子長度卻是有很大差異，可能由于物種在長期選擇進化過程中，內含子不同長度的缺失造成.盡管MSTN基因的內含子在不同魚類中有較大的差別，但都顯示了保守的內含子-外顯子邊界，符合GT-AG規則[7].澳洲肺魚MSTN-1上游的順式調控成分包括TATA-box和E-Box，在其5’側翼區具有較高的突變率，發現幾個SNP位點.在3-UTR區發現一個microRNA的靶位點[8].

魚類MSTN基因表達類型明顯不同于哺乳類動物.Tovah等在斑馬魚中系統地分析了MSTN基因亞家族，在這個家族中發現了MSTN基因的表達差異，斑馬魚中存在MSTN-1和MSTN-2，兩個基因序列比較發現一些明顯差異[6].至今在多種魚類中發現了MSTN基因的亞家族，如鯉魚、虹鱒魚有4個基因組成（MSTN1a, MSTN1b,MSTN2a,MSTN2b）.與此同時在石首魚、綠河豚、虹鱒魚、大西洋鮭魚、羅非魚等魚中都獲得了2 種MSTN基因，而且發現兩者的同源性較高，虹鱒的兩個基因序列之間的相似性高達94%[5]，鮭魚的兩種基因之間也具有93%的相似性[9].不過在有些魚類如斑馬魚、鯉魚、大西洋鮭和東方紅鰭鲀中，其MSTN-1和MSTN-2的同源性在61.21%-64.91%，差異較大，可能是在這些魚種MSTN基因重復的發生較早，造成兩個基因在進化中產生較大差異[10].

研究發現兩種基因在不同魚類中表達存在差異，金頭鯛MSTN-1在肌肉等多種組織中表達，而MSTN-2 mRNA僅在腦中表達[10,11].在斑馬魚發育過程的研究中發現，MSTN-1表達存在整個胚胎生成期，而MSTN-2的表達局限在體節形成早期階段，這表明MSTN-2與骨骼肌的增長和發育是密切相關的，并且成年斑馬魚在遭受環境壓力的過程中MSTN-1和MSTN-2在多種組織中表達[12].魚類兩個不同MSTN基因的差異表達可能是基因復制的結果[13].Oldham IM等也認為兩個基因型的出現與進化過程中基因組倍增事件相關[14].

Mcpherron等人以小鼠保守的C-末端cDNA為探針對不同物種的骨骼肌cDNA進行篩選，克隆了人、豬、鼠、牛、斑馬魚等物種的cDNA序列，對MSTN基因序列分析表明：MSTN基因在不同物種間十分保守，而斑馬魚的MSTN基因序列保守性稍差，與上述其它物種的同源性為88%[6].MSTN基因在生物活性區表現出更高的保守性，從側面反映了該基因受到了高度的進化限制和其功能的重要性.

1.2 魚類MSTN基因的時空表達

MSTN基因的表達隨著生物體的發育而發生變化，最初MSTN被認為只存在于骨骼肌中，具有組織特異性，而在其它組織中不存在，但最近的很多研究表明MSTN mRNA和蛋白也存在其它少數特定組織中.魚類和哺乳類、鳥類MSTN基因的組織表達存在差異，魚類MSTN除在骨骼肌表達外，還在多個組織中表達如肝、心、胃、腮、腎、肌肉、腦等.盡管不同物種的表達譜存在差異，但在肌肉中都檢測到了較高的表達.如在泥鰍MSTN的組織RT-PCR檢測結果MSTN基因在肌肉中強烈表達，在眼組織中微弱表達，其它所檢測的組織中未見表達[9]；斑馬魚MSTN可以在骨骼肌、肝、心、胃、鰓、卵巢、精巢、腎、眼和腦等所檢測的組織中表達[15]；銀頭鯛稚魚發育過程中，可以在皮膚、腦、肌肉、咽、鰓、胰和肝中檢測到MSTN，變形后還可以在食管、胃、腸、腎中檢測到[5]；采用半定量RT-PCR方法，檢測到MSTN基因mRNA在松江鱸肌肉、腦、腸和肝臟等不同組織的表達情況，發現在肌肉中MSTN mRNA表達量最高，腸組織中表達量次之，腦中有微量表達，肝臟中有痕量表達[16]；鱤MSTN基因在骨骼肌和腦中表達量較高，在心肌中也有較高表達，在腎臟、腸、鰓和肝臟中未見表達[17]；作者在對赤眼鱒MSTN基因組織表達分布檢測時，發現在肌肉、腦、脾臟、腎和鰓組織中檢測到MSTN基因的表達，在肌肉和腦中表達量較高，鰓組織表達較弱，脾臟和腎臟痕量表達，其它組織未發現明顯表達（未發表資料）.MSTN的廣泛分布及不同類型的存在表明，魚類中的MSTN除了參加肌肉的生長和發育調控外，還可能參與其它組織和細胞的發育[18].

2 MSTN的作用機理及生物學功能

2.1 MSTN的作用機理

MSTN作為TGF-β家族成員，其作用通過使細胞周期停留在G1期而抑制多種類型的哺乳動物細胞的細胞周期進程.MSTN基因通過阻斷細胞周期的G1和G2/M期來抑制成肌細胞的生長，影響成肌細胞在細胞周期中的分配比例，使G1和G2/M期細胞數量增加，而S期細胞數量顯著減少.這種阻止是由許多細胞周期機制中的因子介導的，G1和S期進程受多級周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶（Cdks）共同調控，激酶活性又受Cdk抑制劑抑制[19].用MSTN處理成肌細胞發現，其可特異性上調p21的表達量，減少和降低了Cdk2的表達量和活性.此外還觀察到Rb蛋白磷酸化減少，推測MSTN是通過使Rb蛋白去磷酸化、p21使cyclin-E和Cdk2失活，使成肌細胞生長阻止于G1期.

2.2 MSTN基因信號轉導途徑

目前公認的MSTN的信號傳導途徑是MSTN-ActRⅡB型受體（蛋白激酶受體）-Smad蛋白信號傳導通路.其中涉及3類Smad蛋白：受體激活型Smad蛋白-Smad3、協同型Smad蛋白-Smad4和抑制型Smad蛋白-Smad7.MSTN與質膜上的受體蛋白結合后，使Smad2/3磷酸化激活，接著與Smad4形成復合體，進入細胞核與基因的調控序列結合促進或抑制相應基因的轉錄.但Smad2/3，Smad4復合體和Smad7調控序列上的SBE（Smad結合因子）結合后，促進Smad7的表達；而Smad7抑制Smad2/3磷酸化、Smad2/3與Smad4形成復合體，抑制MSTN誘導的轉錄，形成負反饋調節[2].

2.3 MSTN的基因表達調控

肌肉發育過程中及出生后其MSTN基因表達受到與肌肉發生有關因子的轉譯調控.研究發現來自小鼠、牛、豬和人約1.6Kb的啟動子序列能上調MSTN基因的表達，說明肌肉專一性的基因轉譯與一些DNA序列相關，它們在這些物種是保守的.常見的肌肉專一性轉譯因子是E-box與MRFs：如MyoD、Myf5、Myogenin 等.Rios等發現MSTN過度表達可下調MyoD、MyoG的mRNA水平.降低MSTN的表達，則可以提高MyoD、MyoG的轉錄，而對IGF-1和Myf5沒有影響[20].Sharrna等研究發現在牛的肌肉發育過程中，MSTN的表達時間與MyoD基本一致，并且兩者在快肌中都有優勢表達[6]，因此MyoD可能是肌肉發育過程中成肌細胞增殖分化時調節MSTN表達的一個主要調控因子.

2.4 MSTN基因的生物學功能

McPherron等通過基因敲除技術構建了MSTN基因突變純合體小鼠，不僅可以存活還能正常生育，體重與野生型相比增加30%，骨骼肌纖維數量明顯增加，且不受性別與年齡的限制[3]，MSTN表現的調控作用主要有2種形式：調控肌細胞增生或者肌細胞肥大.這一結果在斑馬魚MSTN基因滅活的實驗中也得到了驗證：MSTN基因滅活的斑馬魚比對照組體重增加了45%[12].目前世界著名的比利時藍牛和皮埃蒙特牛，就是由于MSTN基因突變而出現雙肌現象[21].

魚類MSTN基因雖然表達分布廣泛，但其基本功能仍然與肌肉的發育相關.為了研究MSTN基因在魚類肌肉發育和生長中的作用，Xu等利用肌肉特異性啟動子獲得了在骨骼肌中過量表達MSTN功能前區的轉基因斑馬魚，結果表明MSTN功能前區對MSTN功能有抑制作用[22].表達MSTN功能前區的轉基因斑馬魚對生肌基因的表達、胚胎階段快慢肌細胞的分化未顯示明顯的影響，肌纖維的大小也沒有明顯的不同，然而骨骼肌纖維的數目卻明顯增加，因此可得知魚類MSTN在生肌過程和肌肉生長中起著重要的抑制作用.用反義的Morpholinos抑制斑馬魚MSTN的表達后，受精后20h，處理的胚胎生長快、個體大，體節數目多、體節長度和寬度增加[14].這些研究結果說明魚類MSTN基因的主要功能與哺乳動物相似，對生肌過程和肌肉生長發育起著重要的抑制作用.

MSTN缺失或基因突變還會對脂肪的沉積起抑制作用.Alexandra等研究發現，MSTN基因突變純合體小鼠的脂肪量比對照組平均少70%[23].在對野生型和肥胖型小鼠進行藥理學實驗說明MSTN基因決定脂肪的生成方向但不決定其分化[3].最新研究結果表明MSTN通過PPARγ和c/EBPα的表達水平來抑制前脂肪細胞的分化.并且MSTN可以顯著激活兩種油脂代謝速率限制酶的磷酸化[24].魚類MSTN基因在多種組織中廣泛分布間接證實魚類MSTN功能可能并不局限于對肌細胞生長的抑制，在其他組織細胞及代謝途徑中也能發揮相應的生物學功能.

3 魚類MSTN基因多態性研究

許多研究表明，MSTN基因在動物進化過程中較保守，但目前在多種魚類MSTN基因中發現微衛星序列和一些SNP位點.薛良義等在眼斑石首魚MSTN基因內含子Ⅰ和3’-UTR區內分別發現了（TC）4CC（TC）4CT（TC）4和（AC）7微衛星序列[25]；在大黃魚MSTN基因的3’-UTR中存在非完美型的微衛星序列（CA）30TA （CA）26

[26]；金頭鯛MSTN基因的內含子Ⅱ和3’-UTR區內都存在（AC）n重復序列[27]；石鼓魚MSTN基因序列的3’-UTR區存在（AC）29微衛星序列[28]；斑點叉尾鮰的MSTN基因序列內包含著多種微衛星序列：外顯子Ⅰ內一段（CAG）6重復序列編碼連續的谷氨酸，內含子Ⅰ內包含（GTTT）n、（TG）n和（TA）n三種重復序列，內含子Ⅱ內存在（GAA）n重復序列，3’-UTR內存在（AC）n重復序列[29]；松江鱸MSTN基因內含子Ⅱ中發現（AC）14的微衛星序列[6].Kocabas等人在對鯰魚ORF的測序中發現了多個SNP位點，這些位點多數是中性突變，并不導致氨基酸的改變[29].澳洲肺魚MSTN-1基因5’側翼區具有較高的突變率，發現幾個SNP位點[8].Nadjar-Boger等發現金頭鯛的MSTN-2基因5-側翼啟動子區和內含子I存在變異，都有3個等位基因[11].這些結果說明魚類MSTN基因內存在微衛星序列和SNP位點是比較普遍的.這些微衛星序列和SNP位點的發現可能作為魚類肌肉生長性狀相關的一個非常有用的分子標記，用于篩選對生產有利的突變，促進漁業生產.

4 MSTN基因在魚類生產中的應用前景及展望

MSTN作為肌肉生長的抑制基因，是肌肉生長的負調控因子，其結構、表達調控和遺傳變異的研究不僅加深人們對肌肉分化、發育和生長機制的了解，并且具有廣泛的應用前景.目前MSTN基因在魚類應用研究的前景和主要方向是：篩選MSTN基因的抗體或抑制劑，使之與MSTN基因表達蛋白結合從而降低或滅活其功能，利用此途徑開發安全可靠的魚飼料添加劑；利用MSTN分子標記技術結合傳統的數量育種選培肉質性狀優良的魚類；利用基因同源重組技術（基因敲除技術）獲得MSTN基因缺失的魚類；在魚培養細胞中進行MSTN基因的敲除或者人工突變，用MSTN基因改變的細胞作為供體進行核移植，生產MSTN基因修飾的魚，這種魚將具有肌肉生產量大、脂肪含量少的優良特點；利用RNAi技術干擾MSTN mRNA的表達，從而解除或緩解MSTN基因對肌肉細胞的抑制作用.結合體細胞基因敲除、RNA干擾、反義核酸和轉基因技術，探索提高現有魚類肌肉重量和質量具有可能性，也適于對一些地方品種進行改良.總之，在魚類養殖上對MSTN基因的深入研究是必要的，今后該基因的開發和應用將會有更為廣闊的前景.

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Research Progress of Fish Myostatin Gene

SHAO Fang,LU Xiang-yun,GU Zhi-liang
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Myostatin(MSTN),a member of transforming growth factor superfamily,is a negative regulator of skel?etal muscle growth.Fish MSTN gene family is complex,with various homologous genes.The structure,type,tem?poral and spatial expression characteristics of fish MSTN gene,mechanism and biological function of myostatin, polymorphisms of fish MSTN gene and its potential application in fish production will be reviewed in the paper.

myostatin;homologous genes;polymorphism

Q341；S917.4

A

1008-2794（2011）08-0076-05

2011-06-30

江蘇省高校自然科學研究計劃（09KJD240001）；蘇州市2010年度科技基礎設施建設項目（SZSD201001）；常熟理工學院2010大學生創新實踐計劃項目.

邵芳（1989—），女，江蘇建湖人，常熟理工學院生物與食品工程學院生物科學專業2007級本科生.

顧志良（1968—），男，江蘇常熟人，常熟理工學院生物與食品工程學院教授，博士，研究方向：動物分子遺傳學，E-mail：zhilianggu88@hotmail.com.