雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質脫除工藝優化

丁 龍，陶 旭，張 燕，蘇 薇，陳 銘，劉 暢，劉靜波*

(吉林大學營養與功能食品實驗室，吉林 長春 130062)

雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質脫除工藝優化

丁 龍，陶 旭，張 燕，蘇 薇，陳 銘，劉 暢，劉靜波*

(吉林大學營養與功能食品實驗室，吉林 長春 130062)

以雞蛋殼膜為原料，用乙醇沉淀法脫除蛋白質以提取唾液酸。利用二次回歸中心組合設計對影響蛋白質去除率和唾液酸回收率的乙醇體積分數、加熱溫度、加熱時間、pH值4個因素進行回歸分析和優化，建立四元二次回歸模型。結果表明因素的影響大小順序為：乙醇體積分數＞加熱溫度＞pH值＞加熱時間，確定最佳工藝參數為：乙醇體積分數30%、加熱溫度80℃、加熱時間1h、pH2。在此條件下，蛋白質去除率為52.3%，唾液酸回收率為82.1%，經驗證實驗得到實驗結果與模型預測值吻合，說明建立的模型確實可行。

雞蛋殼膜；唾液酸；蛋白質；響應面法

唾液酸(sialic acid，SA)是一類神經氨酸的衍生物，是以九碳酮糖酸-神經氨酸為骨架，并具有吡喃糖結構的酸性氨基糖，通常在糖蛋白和糖脂的末端以糖苷的形式存在[1]。唾液酸廣泛分布于自然界中，但以哺乳動物大腦和乳液中含量最多[2]，因其與神經系統的發育[3]、記憶與學習能力形成[4]、細胞識別與信息傳遞[5]等有緊密聯系而成為研究熱點。唾液酸在分子生物學[6]和化學合成[7]中的研究已多見報導，但關于唾液酸的生物提取因其活性成分復雜、含量少而比較困難，Blix等[8]用較為溫和的水解方法從頜下腺黏蛋白中首先分離出了唾液酸，后來有Juneja等[9]從禽蛋的蛋黃膜和系帶中提取出唾液酸等，高劍峰等[10]曾報導了以豬血為原料提取唾液酸的工藝，李文強等[11]研究了從大腸桿菌發酵液中分離純化得到聚唾液酸的工藝等。

我國是禽類養殖大國，雞蛋的食用多為傳統的直接食用方法，每年約有400萬噸廢棄雞蛋殼造成資源的浪費以及生態環境的嚴重污染[12]。而雞蛋殼膜中唾液酸的含量相當可觀，約為0.02%[13]，本實驗以雞蛋殼膜為原料，經過水解，然后用乙醇沉淀法除去水解液中占絕大部分的蛋白質以提取唾液酸。采用響應面設計法考察乙醇體積分數、加熱溫度、加熱時間和pH值及其交互作用對試驗結果的影響，通過建立四元二次回歸模型確定最佳工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋殼 吉林大學農學部學生一食堂；牛血清白蛋白(分子生物學級) 美國Amresco公司；唾液酸標準品、考馬斯亮藍G-250 美國Sigma公司；水合茚三酮、冰乙酸(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、鹽酸、硫酸(均為分析純) 北京化工廠；濃磷酸(分析純) 天津市北聯精細化學品開發有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司；R-250型旋轉蒸發儀 瑞士Buchi公司；AG204型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；CR20B2型高速冷凍離心機 日本日立公司；PHS-3B精密pH計 上海雷磁公司；FN-200高速萬能粉碎機 寧波薪芝公司；Cs501sp型超級恒溫器 上海虹錦屏有限公司通洲分公司。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋殼膜中唾液酸提取工藝流程

雞蛋殼→清洗→殼膜分離→雞蛋殼膜→干燥、粉碎→水解→真空抽濾→減壓濃縮→乙醇沉淀蛋白→離心去沉淀→樣品

1.3.2 蛋白質的定量檢測

采用考馬斯亮藍結合法測定樣品中蛋白質含量[14]。

1.3.4 因子貢獻率計算公式

式中：β為因子貢獻率/%；sj和fj分別為試驗因素j的偏差平方和與自由度；se和fe分別為誤差的偏差平方和與自由度；s為總偏差平方和。

1.3.5 試驗設計

乙醇的加入能改變蛋白質溶液的介電常數導致蛋白質溶解度下降，同時加熱能促使蛋白質變性沉淀。本試驗通過向減壓濃縮后的雞蛋殼膜水解液中加入適量無水乙醇，選擇無水乙醇添加量、加熱溫度、加熱時間和溶液pH值為試驗因素。先以單因素試驗初步確定對蛋白質去除率有顯著影響的各因素水平范圍，然后進行二次正交中心組合設計試驗。

1.3.5.1 單因素試驗

固定加熱溫度8 0℃、p H 3、加熱時間1 h，考察乙醇體積分數分別為20%、30%、40%、50%、60%時對蛋白質去除率的影響，以確定適宜的乙醇體積分數。

固定乙醇體積分數40%、pH3、加熱時間1h，考察加熱溫度分別為50、60、70、80、90℃時對蛋白質去除率的影響，以確定適宜的加熱溫度。

固定乙醇體積分數40%、加熱溫度80℃、pH3，考察加熱時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h時對蛋白質去除率的影響，以確定適宜的加熱時間。

固定乙醇體積分數40%、加熱溫度80℃、加熱時間1h，考察pH1、2、3、4、5時對蛋白質去除率的影響，以確定適宜的p H值。

1.3.5.2 二次正交中心組合設計試驗

選擇4個因素χ1(乙醇體積分數)、χ2(加熱溫度)、χ3(加熱時間)、χ4(pH值)為自變量進行組合試驗設計。根據單因素試驗結果，設計二次中心組合設計試驗因素編碼表，如表1所示，試驗均按隨機順序進行。利用Design Expert軟件中的Central Composite進行乙醇體積分數、加熱溫度、加熱時間和pH值4個因素對蛋白質去除率和唾液酸回收率的響應面分析，并對獲得的回歸模型進行顯著性檢驗。

表1 雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質脫除工藝二次組合設計因素編碼表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 蛋白質和唾液酸測定標準曲線回歸方程

吸光度A595與蛋白質質量濃度(C)/(μg/mL)的相關標準曲線回歸方程：A595＝0.0062C＋0.0859，相關系數R2＝0.9978，吸光度A470與唾液酸質量濃度(C)/(μg/mL)的相關標準曲線回歸方程：A470＝0.0022C-0.0073，相關系數R2＝0.9989，在試驗范圍內線性關系均良好，能滿足本試驗需要。

2.2 單因素試驗結果分析

圖1 各因素對蛋白質去除率的影響Fig.1 Effect of each factor on protein removal rate investigated by onefactor-at-a-time design

由圖1可知，當乙醇體積分數在20%～60%之間增加時，蛋白質去除率有明顯增大，乙醇體積分數60%時的蛋白質去除率約是30%時的2倍；當加熱溫度在50～90℃之間、pH值在1～5之間增大時，蛋白質也有較明顯的增大，但增加幅度沒有乙醇體積分數大；加熱時間在0.5～2.5h之間增大時，蛋白質去除率呈上下波動變化趨勢，且波動幅度不明顯，說明加熱時間對乙醇去除率的影響不顯著。

2.3 回歸模型的建立

利用Design Expert軟件對表2的試驗數據進行回歸分析，得到回歸模型如下：

表2 雞蛋殼膜提取唾液酸過程中蛋白質脫除工藝二次中心組合設計試驗方案與結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.1 回歸模型檢驗

蛋白質去除率回歸模型(式4)的方差分析表明(表3)，此模型的決定系數R2＝0.8337，響應面回歸模型接近高度顯著水平(P＝0.0013)，逐步顯著性檢驗結果表明，交互項對回歸模型影響不顯著，二次項有顯著影響，一次項有極顯著影響，決定系數為0.5887，對回歸模型系數的顯著性檢驗表明，χ3、χ1χ3、χ2χ3、χ2χ4、χ3χ4不顯著，χ1χ2、χ12、χ22、χ32在可以接受的水平，χ1、χ2、χ4、χ1χ4、χ42顯著，其中χ1為高度顯著性。回歸模型失擬項P＝0.1110＞0.05，不顯著，說明該回歸模型能夠很好的擬合試驗結果。

唾液酸回收率回歸模型(式5)的方差分析表明(表3)，此模型的決定系數R2＝0.9665，響應面回歸模型達到高度顯著水平(P＜0.0001)，逐步顯著性檢驗結果表明，交互項對回歸模型影響不顯著，二次項和一次項有極顯著影響，決定系數達到0.72641，對回歸模型系數的顯著性檢驗表明，χ3、χ1χ4、χ3χ4、χ32不顯著，χ4、χ1χ2、χ2χ4在可以接受的水平，χ1、χ2、χ1χ3、χ2χ3、χ12、χ22、χ42均達到顯著性水平，且χ1、χ12為高度顯著性。回歸模型失擬項P＝0.8128＞0.05，不顯著，說明該回歸模型能夠很好的擬合試驗結果。

表3 二次響應面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the created regression models for protein removal rate and sialic acid recovery

2.4 回歸模型的分析

2.4.1 因子貢獻率

采用因子貢獻率來比較各因子對試驗結果影響的大小。各因子貢獻率見表4，可以看出，線性項和二次項是回歸模型的主導效應。對于蛋白質去除率，各試驗因素的效應影響大小順序為χ1(乙醇體積分數)＞χ4(pH值)＞χ2(加熱溫度)＞χ3(加熱時間)，對于唾液酸回收率，各試驗因素的效應影響大小順序為χ1(乙醇體積分數)＞χ2(加熱溫度)＞χ4(pH值)＞χ3(加熱時間)。

表4 各因子貢獻率表Table 4 Contribution rate of each term in the created regression models to protein removal rate and sialic acid recovery

2.4.2 單因素效應分析

圖2 各單因素水平與蛋白質去除率的回歸曲線Fig.2 Effect of each factor on protein removal rate investigated based on the created regression model

由因子貢獻率分析得到，對回歸模型影響最大的是各因素的一次效應，即單因素。控制4個因素中的3個因素在零水平，分別得到各個因素的單因素模型，各因素的單因素效果圖見圖2、3。從圖2、3可以看出，隨著乙醇體積分數、加熱溫度和pH值的增大，蛋白質去除率隨著增大，但唾液酸的回收率卻隨之降低，其中乙醇體積分數對蛋白質去除率和唾液酸的回收率的作用均最顯著，加熱溫度和pH值次之，而加熱時間的變化對蛋白質去除率和唾液酸回收率幾乎沒有影響。

圖3 各單因素與唾液酸回收率的回歸曲線Fig.3 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on protein removal rate

2.4.3 交互作用效應分析

圖4 各交互因素對蛋白質去除率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on sialic acid recovery

以蛋白質去除率為響應值，對乙醇體積分數、加熱溫度、加熱時間和pH值4個因素作響應面圖，見圖4。從圖4可以看出，乙醇體積分數與加熱溫度、乙醇體積分數與pH值的交互效應最顯著，在試驗考查范圍內同時增大乙醇體積分數與加熱溫度、增大乙醇體積分數與pH值均能使蛋白質去除率迅速增大，并接近最大值，而且響應值對乙醇體積分數的變化比加熱溫度和pH值都要敏感很多，其最優點分別趨近于乙醇體積分數70%與加熱溫度80℃、乙醇體積分數70%與pH6。其他交互作用效應并不很顯著，其最優點分別為：乙醇體積分數70%與加熱時間1h、加熱溫度80℃與加熱時間1h、加熱溫度80℃與pH6、加熱時間1h與pH6，并且響應值分別在這些點附近達到最大值。

以唾液酸回收率為響應值，對乙醇體積分數、加熱溫度、加熱時間和pH值4個因素作響應面圖，見圖5。從圖5可以看出乙醇體積分數與加熱溫度、乙醇體積分數與加熱時間、加熱溫度與加熱時間、加熱溫度與pH值的交互效應顯著，響應值對乙醇體積分數的變化最為敏感，當乙醇體積分數增大時，響應值顯著減小，即在試驗范圍內，當乙醇體積分數越小時，唾液酸回收率越高。同時減小乙醇體積分數與加熱溫度、乙醇體積分數與pH值對唾液酸回收率的促進均有顯著作用。

圖5 各交互因素對唾液酸回收率影響的響應面圖Fig.5 Response surface of each factors on the sialic acid recovery rate

2.5 回歸模型尋優

分別對蛋白質去除率和唾液酸回收率的四元二次多項式數學模型解逆矩陣，蛋白質去除率的最佳工藝參數為：乙醇體積分數52.6%、加熱溫度79.6℃、加熱時間1.1h、pH2.2，預測的最大蛋白質去除率為54.9%；唾液酸回收率的最佳工藝參數為：乙醇體積分數51.9%、加熱溫度77.4℃、加熱時間0.7h、pH3.9，預測的最低唾液酸回收率為66.57%。而利用Design Expert Numerical Optimization對蛋白質去除率和唾液酸回收率的回歸模型進行尋優，得到使蛋白質去除率最大時的工藝參數為：乙醇體積分數66.4%、加熱溫度61.5℃、加熱時間0.7h、pH6.0，蛋白質去除率為71.0%，使唾液酸回收率最大的工藝參數為：乙醇體積分數23.7%、加熱溫度47.5℃、加熱時間1.3h、pH2.3，唾液酸回收率接近100%。由于乙醇對蛋白質去除率的影響最大，要使蛋白質有較大的去除率，就必須使用比較大的乙醇體積分數，而較大的乙醇體積分數又會造成唾液酸回收率的下降[16]，因此綜合考慮蛋白質去除率和唾液酸回收率，結合實際，確定比較合適的工藝參數為：乙醇體積分數30%、加熱溫度80℃、加熱時間1h、pH2，預測的蛋白質的去除率為52.3%，唾液酸回收率為82.1%。

3 結 論

利用二次正交中心組合設計，通過Design Expert軟件中的 Central Composite對影響蛋白質去除率和唾液酸回收率的乙醇體積分數、加熱溫度、加熱時間、pH值4個因素進行回歸分析和優化，經F檢驗，該回歸模型不失擬，能很好地擬合雞蛋殼膜水解液提取唾液酸反映的真實情況，因子貢獻率分析表明，各因素對唾液酸提取的影響大小順序為乙醇體積分數＞加熱溫度＞pH值＞加熱時間，最后綜合考慮蛋白質去除率和唾液酸回收率，結合實際情況，得出唾液酸提取的最佳工藝參數為：乙醇體積分數30%、加熱溫度80℃、加熱時間1h、pH2。這與李文強等[11]曾報導的發酵液中聚唾液酸分離純化過程中除蛋白質的研究結果較為接近，所添加乙醇體積分數的不同可能是由于雞蛋殼膜水解液中聚唾液酸的含量較少，而唾液酸單體較多。

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Deproteinization Optimization for Sialic Acid Extraction from Eggshell Membranes by Response Surface Methodology

DING Long，TAO Xu，ZHANG Yan，SU Wei，CHEN Ming，LIU Chang，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, Jilin University, Changchun 130062, China)

In this study, eggshell membranes were used as the raw material to extract sialic acid based on deproteinization by ethanol precipitation. A four-factor, five-level central composite design combined with multiple regression analysis was employed to mathematically model protein removal rate and sialic acid recovery as a response to ethanol concentration, temperature, heating time and pH, respectively. Ethanol concentration was identified to be the most significant affecting factor, followed by temperature, pH and heating time. The optimal deproteinization conditions were determined to be: ethanol concentration 30%, temperature 80 ℃, heating time 1 h and pH 2. Under these conditions, the removal rate of protein was predicted to be 52.3% and the recovery of sialic acid 82.1%, closely agreeing with the experimental values, respectively. Thus, the created models are reliable.

eggshell membranes；sialic acid；protein；response surface methodology

TS253.1

：A

1002-6630(2011)20-0114-07

2011-06-28

吉林大學“大學生創新性實驗計劃”項目(2010B83176)

丁龍(1988—)，男，本科生，研究方向為營養與功能性食品。E-mail：dinglong178@126.com

*通信作者：劉靜波(1962—)，女，教授，博士，研究方向為營養與功能性食品。E-mail：ljb168@sohu.com