食品中熒光假單胞菌聚合酶鏈式反應檢測體系的建立和評價

楊一林，周 敏,*，施春雷，楊捷琳，史賢明

(1.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2.上海市出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

食品中熒光假單胞菌聚合酶鏈式反應檢測體系的建立和評價

楊一林1，周 敏1,*，施春雷1，楊捷琳2，史賢明1

(1.上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2.上海市出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

建立用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測食品中熒光假單胞菌的方法。分別針對16～23S rRNA基因間隔區序列、gyrB基因以及通過生物信息學方法發掘到的4個種特異性基因設計6對檢測引物，通過初步特異性實驗，篩選出一對種特異性最佳的引物。最終建立以gyrB基因為檢測靶點的PCR擴增體系，并對體系進行系統評價。結果表明：該方法可特異檢測熒光假單胞菌的存在，純DNA檢測靈敏度為14.9fg/μL (2～3拷貝/μL)，純培養物檢測靈敏度為2.8×102CFU/mL。豆奶樣品經15h充分增菌可提高檢測靈敏度至0.28CFU/25g。

熒光假單胞菌；gyrB基因；聚合酶鏈式反應(PCR)；檢測；食品

熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)是屬于假單胞菌屬的嗜冷微生物，為革蘭氏陰性，能產生水溶性的黃綠色熒光色素[1]。熒光假單胞菌廣泛存在于水和土壤當中，在冷藏的高蛋白、高脂肪食品(生肉、生牛奶等)中，它是導致食品腐敗的優勢菌群[2-3]。臨床上，該菌主要感染先天性和獲得性免疫缺陷的人群，進入患者血液會導致敗血癥、感染性休克和血管內凝血等嚴重后果，是典型的“條件致病菌”[4-6]。隨著冰箱的普及，食品中此類菌誘發食物中毒、危害人體健康的可能性日趨增大[7-8]。

目前，國內對熒光假單胞菌的檢測鑒定依然以傳統培養方法為標準，該方法檢驗過程耗時、繁瑣，不能滿足快速高通量監測食品樣品的要求。而基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的檢測方法靈敏、特異、快速，已被廣泛應用于食源性致病菌的檢測。檢測靶點是分子檢測方法的關鍵，隨著生物信息學技術的發展，3株熒光假單胞菌(pf 0-1、pf-5、pf SBW25)的基因組完成測序，為檢測靶點的選擇和特異引物的設計提供了足夠的依據，通過多重序列BLAST比對可快速發掘新的特異檢測位點。

熒光假單胞菌的PCR檢測還處于起步階段，2004年Scarpellini等[9]針對16S rRNA 基因設計了引物16SPSEfluF/R，目前常被應用于檢測和鑒定熒光假單胞菌。2009年，Irenehanning等[10]利用gyrB基因的特異性，將熒光假單胞菌和莓實假單胞菌這兩種細菌和其他假單胞菌分開，但沒有對這對引物做系統評價。2010年，鄧顯文等[11]依據16～23S rRNA基因間隔區序列建立PCR檢測體系，診斷羅非魚的熒光假單胞菌病，但僅對4株熒光假單胞菌分離株進行了驗證。本研究將通過生物信息學手段，尋找新的種特異性的檢測靶點，針對這些靶點以及16～23S rRNA基因間隔區序列與gyrB基因設計和篩選出新的種特異性強的引物，建立和優化熒光假單胞菌PCR檢測體系，并對其進行系統評價，旨在形成一套快速、準確、安全的熒光假單胞菌檢測方法，為食品安全監測提供技術支撐和有力的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細菌菌株

實驗所用菌株名稱和來源見表1。實驗菌株均為-80℃甘油管保存。

表1 菌株及PCR檢測結果Table 1 Strains used in the study to characterize PCR specificity

續表1

1.1.2 培養基與試劑

非選擇性培養基：營養肉湯培養基(NB培養基)；營養肉湯瓊脂培養基(NA培養基)。

選擇性培養基：假單胞菌瓊脂培養基(英國Oxoid公司)；選擇性增菌液[12]。

實驗所用種特異性引物序列gyrBF/R、ITSF/R(表2)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；測序工作委托北京六合華大基因有限公司完成。

Taq酶等PCR反應試劑 深圳富酶泰斯生物技術有限公司；100bp DNA Marker 北京天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒 上海星漢生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PTC-200 PCR儀 美國Bio-Rad公司；GIS 2020系列數碼凝膠圖像處理系統 上海天能科技有限公司；HZ-8211K恒溫振蕩器 太倉市科教器材廠；EPS 301電泳儀美國Amersham Biosiences公司；Thermomixer comfort恒溫混勻器、5415D高速離心機 德國Eppendorf公司；ES-315高壓蒸汽滅菌器 日本Tomy公司；CA-1480-2垂直層流潔凈工作臺 上海上凈凈化設備有限公司；DHP-9162恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；DU800紫外核酸蛋白分析儀 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

實驗所用熒光假單胞菌于28℃條件下培養，非熒光假單胞菌于37℃條件培養。

1.3.2 基因組DNA的提取

在不同的實驗中分別采取苯酚-氯仿-異戊醇法或煮沸法提取核酸DNA[13]。

1.3.3 引物設計

根據熒光假單胞菌pf SBW 25的基因組測序結果，通過本實驗室建立的軟件平臺[14]，將其所有CDS序列與其他常見食源性致病菌全基因組進行BLAST比對，得到237個種特異性的基因(E值＞0.1)，再經手動在線BLAST比對，發掘得到4個熒光假單胞菌種內保守的基因(同源性＞70%)。這4個基因分別編碼AraC家族轉錄調控子和不同的假性蛋白。采用primer premier 5.0軟件設計引物，經過primer-BLAST比對，篩選出理論上可以特異擴增熒光假單胞菌的引物對。

另外，熒光假單胞菌不同菌株的16～23S rDNA序列區間和gyrB基因DNA序列分別具有較高同源性，且具有種特異性。在GeneBank中查找到熒光假單胞菌不同菌株的上述基因序列，經CLUSTALX 1.8.1比對分析，找到種間特異種內保守區段設計引物并進行理論篩選。

使用設計出的引物對假單胞菌屬的菌株(表1)進行PCR反應驗證，最終篩選出特異性好的引物gyrBF/R進行后續實驗。引物信息如表2所示。本研究將引物16SPSEfluF/R作為對照，考察新體系的相對優勢。

1.3.4 PCR反應體系建立

PCR體系和反應程序如2.2節所述，其中Mg2+添加量和退火溫度經優化之后確定。PCR產物進行瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳(160V、30min)，溴化乙錠染色10min，用GIS凝膠成像系統觀察分析電泳結果。

1.3.4.1 Mg2+濃度優化實驗

設置一系列的Mg2+濃度梯度，使每個反應體系中的Mg2+濃度分別為1.25、1.875、2.5、3.125μmol/L。分別在這4個梯度上進行PCR擴增(以熒光假單胞菌CICC21896基因組DNA為模板)，根據電泳結果的條帶亮度和寬度以及有否非特異性擴增，確定最佳的Mg2+濃度。

1.3.4.2 退火溫度優化實驗

參考引物設計軟件的推薦Tm值(56.6℃)，在Tm±5℃范圍內設置12個溫度梯度(52～62℃)，以熒光假單胞菌CICC21896基因組DNA為模板分別進行擴增，根據電泳結果的條帶亮度和寬度以及有否非特異性擴增，確定擴增退火溫度。

表2 引物序列信息Table 2 Information about the primers used in this study

1.3.5 PCR檢測體系評價

1.3.5.1 特異性評價

對表1中所列出的菌株分別進行PCR擴增，以滅菌蒸餾水為空白對照。如電泳結果在271bp處出現條帶，則為陽性檢測結果。將陽性條帶割膠回收，進行測序，并對測序結果進行BLAST比對，確定擴增產物序列是否與設計目的片斷一致。

1.3.5.2 靈敏度評價

純DNA水平靈敏度評價：提取熒光假單胞菌AS1.55基因組DNA，使用含100μg/mL RNaseA的無菌水處理，測定核酸濃度。10倍梯度稀釋至10-10水平，對每個濃度梯度分別進行PCR擴增，以滅菌蒸餾水為空白對照，檢測引物靈敏度。

純培養物水平靈敏度評價：將培養12h的熒光假單胞菌AS1.55菌液，進行10倍梯度稀釋至10-10水平，選取10-6、10-7、10-8三個稀釋倍數梯度進行平板計數，同時對每個梯度水平的菌液采取煮沸法提取基因組DNA，分別進行PCR擴增，以滅菌蒸餾水為空白對照，檢測引物靈敏度。

1.3.5.3 抗干擾能力評價

選取惡臭假單胞菌(ATCC17485)、銅綠假單胞菌(IQCC12625)、產堿假單胞菌(IQCC12604)和洋蔥假單胞菌(CICC21624)4株干擾菌，與熒光假單胞菌(AS1.55)分別培養至穩定期，10倍梯度稀釋，分別計數，將4種干擾菌混合，設置3個干擾濃度(N×104、N×106、N× 108)，與熒光假單胞菌不同梯度稀釋液分別混合搖瓶培養(28℃、150r/min)，于0h和15h(依據人工污染的結果選取)分別取樣1次，煮沸法提取基因組DNA，分別進行PCR擴增，以不加入熒光假單胞菌的干擾菌混合液為空白對照，檢測抗干擾能力(圖1)。

圖1 抗干擾實驗設計圖示Fig.1 Experimental scheme to test the presence of background bacteria

1.3.6 人工污染食品樣品實驗

將活化的熒光假單胞菌(AS1.55)菌液接入NB培養基中搖床培養至穩定期，10倍梯度稀釋，平板計數。向225mL選擇性增菌液中接入25mL豆奶，分別接入1～10、10～100、100～1000CFU/mL三個梯度的菌液，平行3次，于0、3、6、9、1 2、1 5、2 4 h各取樣一次，煮沸法提取基因組DNA，分別進行PCR擴增，以滅菌蒸餾水為空白對照。所選食品樣品經培養法[12]證實不含有檢測目的菌。

2 結果與分析

2.1 靶點篩選和引物設計

使用軟件設計的6對引物(表2)對假單胞菌屬的21株菌株分別進行擴增，初步驗證其特異性。結果表明引物Hp2F/R出現了假陽性現象，引物ITSF/R、AraCF/R、Hp3F/R、Hp4F/R則出現了假陰性現象，這是由于各雖同源性較高，但序列中散布著大量突變位點而造成的。故選擇特異性最好的引物gyrBF/R進行后續實驗。

2.2 PCR反應體系建立

圖2 gyrBF/R引物退火溫度優化和Mg2+濃度優化電泳圖Fig.2 Optimization of annealing temperature and Mg2+concentration for PCR using primer gyrBF/R

使用上述方法分別對PCR體系中Mg2+濃度和退火溫度進行優化。從圖2可以看出，當退火溫度為59.9℃和60.8℃時，擴增條帶最清晰明亮，后續實驗在此范圍內選取60℃退火；同樣根據條帶亮度和寬度，選擇Mg2+濃度為1.875μmol/L。

優化后P C R體系：上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板1～10ng，10×buffer 2μL，Mg2+(25mmol/L)1.5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，Taq酶1μL，ddH2O補足至20μL。

優化后PCR反應程序：94℃預變性2 min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，36個循環；72℃延伸10min。

2.3 PCR檢測體系評價

2.3.1 特異性評價

采用優化后擴增體系，利用引物gyrBF/R對11株熒光假單胞菌、10株假單胞菌屬其他種類細菌、18株其他屬常見食源性致病菌分別進行檢測，結果以熒光假單胞菌的基因組DNA為模板，均能擴增出長度為271bp的特異性條帶，而以非熒光假單胞菌基因組DNA為模板則沒有擴增出特異性條帶(表1)。將擴增條帶割膠回收，送交深圳華大基因科技有限公司測序。對測序結果進行BLAST比對，證實擴增條帶與設計目的片斷一致。

引物gyrBF/R具有穩定的種特異性，可準確區分熒光假單胞菌與非熒光假單胞菌，且特異性檢測結果與引物16SPSEfluF/R一致。

2.3.2 靈敏度評價

2.3.2.1 純DNA水平靈敏度評價

提取熒光假單胞菌AS1.55基因組DNA，使用RNA酶水純化，并用DU800測得質量濃度為5.96ng/μL，10倍梯度稀釋至10-10水平，以滅菌蒸餾水為空白對照，分別進行PCR擴增檢測引物靈敏度。如圖2所示，當每個體系中模板終濃度為1.49fg/μL時，無法檢測到目的條帶。因此最終計算得檢測靈敏度為14.9fg/μL (2～3拷貝/μL)。另外，對引物16SPSEfluF/R的評價結果顯示，兩引物純D N A水平靈敏度相同。

2.3.2.2 純培養物水平靈敏度評價

將培養12h的熒光假單胞菌AS1.55菌液進行10倍梯度稀釋至10-10水平，并對其中10-6、10-7、10-8三個梯度進行計數，計算初始菌濃度為1.1×109。同時對每個濃度的菌液采取煮沸法提取基因組DNA，以滅菌蒸餾水為空白對照，分別進行PCR擴增。如圖3所示，當每個體系中模板終濃度為2.8×102CFU/mL時，無法檢測到目的條帶。因此最終計算得檢測靈敏度為2.8× 102CFU/mL。

圖3 引物gyrBF/R (a)與引物16SPSEfluF/R (b)的PCR 檢測純DNA靈敏度檢測電泳圖Fig.3 Detection sensitivity of PCR using primer gyrBF/R and primer 16SPSEfluF/R to pure DNA

圖4 gyrBF/R引物PCR檢測純培養物靈敏度試驗電泳圖Fig.4 Detection sensitivity of PCR using primer gyrBF/R to pure Pseudomonas fluorescens culture

2.3.3 抗干擾能力評價

選取惡臭假單胞菌(ATCC17485)、銅綠假單胞菌(IQCC12625)、產堿假單胞菌(IQCC12604)和洋蔥假單胞菌(CICC21624)與熒光假單胞菌(AS1.55)分別培養至穩定期，10倍梯度稀釋，分別計數，計算得熒光假單胞菌和4種干擾菌純培養物的起始菌液濃度分別為1.1×109、6.8×108、3.4×109、4.8×109、6.8×108CFU/mL。再按1.3.5.3節所述方法進行純培養物的靈敏度實驗，結果如表3所示。

表3 干擾菌的存在對純培養物PCR檢測靈敏度的影響Table 3 Effect of background interference on detection sensitivity of Pseudomonas fluorescens in pure culture

添加約為104CFU/mL的干擾菌純培養物對上述PCR檢測體系的靈敏度幾乎沒有影響，而添加約為108CFU/ mL的干擾菌純培養物時，經過充分的增菌培養也能準確的檢測出熒光假單胞菌。

可見，增菌培養不僅可以提高檢測靈敏度，還可以提高檢測體系的抗干擾能力，因此檢測前的增菌過程是必要的。

2.4 人工污染食品樣品實驗

將活化的熒光假單胞菌(AS1.55)菌液接入NB培養基中搖床培養至穩定期，平板計數得初始菌濃度為2.3× 109CFU/mL。將25mL鮮牛奶樣品用選擇性增菌液稀釋10倍，分別接入濃度為23、2.3、0.23CFU/mL的熒光假單胞菌1 mL，每個濃度平行3次。于0、3、6、9、12、15、24h各取樣1次，煮沸法提取基因組DNA，分別進行PCR擴增，以滅菌蒸餾水為空白對照。檢測結果如表4所示。

表4 人工污染樣品的PCR檢測結果Table 4 PCR detection results for artificially contaminated samples

當初始接菌量為23CFU/mL時，增菌培養12h可檢測到陽性結果；當接菌量為2.3CFU/mL時，增菌培養15h可檢測到陽性結果；培養24h后，初始接菌量為0.23CFU/mL的樣品檢出率為1/3?？梢姡倔w系在樣品含菌量低的情況下，經適當時間增菌可準確檢測到熒光假單胞菌存在。

3 討 論

本研究所建立的PCR檢測體系，可準確區分熒光假單胞菌和非熒光假單胞菌，純DNA水平上檢測靈敏度為14.9fg/μL，純培養物水平上檢測靈敏度為2.8× 102CFU/mL，當背景干擾菌總量為104CFU/mL時，對上述體系檢測靈敏度沒有影響，而當背景干擾菌總量達到108CFU/mL時，經過充分增菌培養，也可以準確檢測熒光假單胞菌的存在。當向不含檢測目的菌的食品樣品中接入濃度為2.3CFU/mL的熒光假單胞菌后，增菌15h即可準確檢測到陽性結果。

本研究設置的比較實驗結果顯示，引物16SPSEfluF/R[9]檢測特異性和純DNA靈敏度結果與gyrBF/R一致。使用鄧顯文等[11]和Irenehanning等[10]建立的體系對表1中的菌株進行擴增時，發現屬內非熒光假單胞菌株多出現假陽性現象。16S r DNA、16～23S rRNA基因間隔區序列和gyrB基因都是細菌分子檢測的常用位點，當使用多重序列比對軟件CLUSTALX進行比較分析時發現：16S r DNA高度保守，如與銅綠假單胞菌的等位基因同源性達到95%，種特異性不強，易將不同種判斷為同一菌種而出現假陽性結果[15]；16～23S rRNA基因間隔區序列則高度變異，同種不同株(pf-5與pf 0-1)之間同源性僅達到83%，易錯將同一菌種判斷為不同種[15]；gyrB基因也比較保守，與惡臭假單胞菌等位基因同源性為85%，但其片斷上有很多種特異的突變位點，可用來設計特異性的檢測引物，這主要是由于遺傳密碼子具有兼并性，使得DNA序列可以發生較多替換而不改變氨基酸序列，尤其對于密碼子第3位核苷酸，因此，gyrB基因特別適用于菌種間的區別和鑒定[16]。

通過CDS比對篩選得到的檢測位點，雖然等位基因同源性較高，但序列中間散布著大量突變位點，保守區段非常短，若用來設計種特異性引物，實際擴增時，會出現假陰性現象。針對這一情況，本實驗嘗試設計了一對簡并引物Hp2F/R，在多次重復實驗中，假單胞菌屬的其他細菌不時會出現假陽性結果，即該引物擴增結果不穩定，而后進行體系優化也沒能解決這一問題。本實驗篩選得到的特異位點可作為熒光假單胞菌的分類依據，為其分子分型方法的建立提供理論支持。

在絕大多數食品樣品中，檢測目的菌都以很低的水平存在，而且食品中的各種物質和復雜的背景菌群會影響檢測靈敏度和準確性，因此，一定時間的選擇性增菌是必要的。雖然增菌培養會使檢測時間加長，且使得檢測結果不能對樣品中目的菌準確定量，但目前大多數食源性致病菌新型分子檢測技術的開發都以增菌培養作為目的菌濃縮分離的首選方法。與培養法[12]需耗時約4d相比，本體系準確檢測食品中微量存在的熒光假單胞菌，僅需大約1 7 h，大大縮短了檢測時長。

研究[17]表明，gyrB基因是以單拷貝的形式存在于細菌中的，因此基于gyrB基因的分子檢測方法可以向定量檢測的方向發展。另外，食品中存在的死亡細菌DNA會干擾檢測結果，降低可信度。相反，RNA僅存在于活菌中，因此，可采用反轉錄PCR，針對RNA進行檢測，彌補現存檢測體系的漏洞。此外，還可在其他環節運用輔助手段區分活菌與死菌，如單疊氮丙錠預處理PCR(PMA- P CR)。死亡細菌的細胞膜會降解，DNA外泄，PMA可與DNA雙鏈緊密結合，使其無法解鏈發生PCR反應。在提取細菌DNA之前，先用PMA處理菌液，排除掉外泄的DNA，之后再按常規方法進行PCR，即可得到針對活菌的檢測結果[18-19]。

綜上所述，本研究基于gyrB基因建立的PCR檢測體系可快速、準確檢測熒光假單胞菌，靈敏度高，值得推廣使用。

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Development and Evaluation of a PCR Assay for Detection of Pseudomonas fluorescens in Foods

YANG Yi-lin1，ZHOU Min1,*，SHI Chun-lei1，YANG Jie-lin2，SHI Xian-ming1
(1. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China；2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

A polymerase chain reaction (PCR) assay for the detection of Pseudomonas fluorescens in foods was developed in this study. Six pairs of detection primers were designed for the 16-23S rDNA internal transcribed spacer sequence, the gyrB gene and 4 specific genes obtained by bioinformatics, respectively. Primary specificity experiments were used to screen the best primer pair out of them. A PCR amplification system targeting the gyrB gene was constructed and evaluated. The results indicated that the developed assay could specifically detect Pseudomonas fluorescens. The specificity was 14.9 fg/μ L for pure DNA, 2.8 × 102CFU/mL for pure culture and 0.28 CFU/ 25 g for soybean milk with 15 h enrichment.

Pseudomonas fluorescens；gyrB gene；polymerase chain reaction (PCR) ；detection；food

TS207.7

：A

1002-6630(2011)20-0185-06

2010-12-30

上海市科學技術委員會技術標準專項(08DZ0504200)；國家質量監督檢驗檢疫總局標準課題(2009IK155)

楊一林(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：ickeyyang1215@gmail.com

*通信作者：周敏(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為食品安全與微生物。E-mail：mzhou2@sjtu.edu.cn