VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達

鄭琦 鄭 根主 許燕紅

翼狀胬肉是指球結膜及纖維血管組織呈翼狀侵入角膜淺層，由一種結膜組織的增殖變性引起的病變。翼狀胬肉是我國常見的眼表疾病，其患病率較高，達到2% ～5%，患病總人數達2 000 萬 ～ 5 000 萬［1，2］。血管內皮生長因子(VEGF)是目前研究發現的功能最強的血管形成促進因子，它可以增強微血管的通透性，刺激內皮細胞分裂，增加組織因子和某些蛋白酶的產生，為成纖維細胞和血管內皮細胞的遷入提供條件基質，為腫瘤細胞的生長和新生毛細血管網的建立提供營養。紫外線致球結膜變性，結膜上皮細胞抑癌基因p53突變，細胞周期調控基因p21/p27kip1表達下降導致球結膜上皮細胞周期紊亂，結膜上皮細胞的端粒酶活性異常增高，凋亡調控基因Bc1/Bax比值上調導致變性結膜上皮細胞具有無限增殖活性;有研究認為翼狀胬肉是結膜組織正常凋亡過程失敗的結果。本項目研究VEGF和P53在翼狀胬肉中表達，通過對VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達的研究，為探索翼狀胬肉的發病機制提供理論依據，同時為臨床藥物研究提供理論支持，從而對降低翼狀胬肉的發生率及復發率也將具有一定指導意義，為預防治療翼狀胬肉提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選 擇本院2009年1至11月門診初發的進行期翼狀胬肉手術患者中選標本30例作為病例組(術后經病理檢查確診是翼狀胬肉的標本)其中男15例，女15例;年齡33～68歲，平均年齡(48.0±5.0)歲;平均病程11個月。同期正常結膜(斜視手術患者結膜)30例作為對照組，其中男14例，女16例;年齡34～68歲，平均年齡(47.4±2.3)歲。所有病例均排除其他角膜、結膜疾患，排除青光眼、虹膜炎及其他眼底疾患，排除全身疾患。

1.2 試劑與儀器 免 疫組化試劑:多聚賴氨酸、一抗(VEGF、P53、河北博海生物工程開發有限公司分裝美國SANTA CRUZ公司產品)、SP、Dab(購于河北博海生物工程開發有限公司)儀器設備顯微鏡:日本奧林巴斯 BX51T-PHD-J11;CMOS:日本奧林巴斯;多功能真彩色細胞圖象分析管理系統:美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus;切片機:德國萊卡RM2015;離心機:北京離心機廠LDZ5-2型;電子天平:瑞士METTER AE100型;移液器:德國EPPENDORF;干燥箱:日本三洋MIR-153型;低溫冰箱:日本三洋MDF-382E型;恒溫水浴箱:江蘇太倉醫用儀器廠 DSHZ-300型;醫用微波爐:浙江臨安愛迪儀器廠YWY781B型。

1.3 方法 取試驗組和對照組標本固定，脫水，包埋組織塊;HE染色。再行取材固定和包埋、切片，脫蠟、入水，加第一抗體，加第二抗體，加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，復染，顯微鏡觀察，選擇病例組和對照組的陽性和陰性組織相，進行×100和×400的顯微照相，選擇有意義的組織相，經登錄、編號、采集、分析、讀取數據、最后存盤。

1.4 結果判斷標準 VEGF結果判定標準:以血管內皮和細胞漿內出現棕色或棕黃色顆粒為陽性染色，以細胞漿內無或少量棕色或棕黃色顆粒為陰性染色。P53結果判定標準:光鏡下觀察，細胞核呈淺黃色或深棕色染色的細胞為P53陽性細胞;細胞漿或細胞膜呈淺黃色或深棕色的細胞為假染色以及無棕黃色染色的細胞均視為P53陰性細胞。表達的強弱均以IHS為準，免疫組化評分(immunohi-stochemical scores，IHS)方法見參照文獻［3］，結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分:a為陽性細胞百分比(無陽性細胞=0，陽性細胞占1%～10%=1，11% ～50%=2，51% ～80%=3，81% ～100%=4)，b為陽性細胞染色強弱(陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強陽性=3)，a，b兩項乘積即為該例組織的IHS。陽性細胞數表示陽性細胞占總體細胞的比例。每張切片在高倍顯微鏡下(×400)隨機選擇5個視野，計算每個視野陽性細胞率，取平均值作為該標本的陽性細胞率。設置b的原因是可能同樣的陽性細胞數會出現顯色不同。HE染色結果:HE結果判定標準:細胞核被蘇木精染成鮮明的藍色，細胞漿被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞漿內嗜酸性顆粒呈反光強的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。

1.5 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，研究病例組與正常組間均采用染色強度及染色陽性率乘積的IHS評分，成組設計兩樣本比較的秩和檢驗，兩樣本比較的秩和檢驗和Spearman秩相關檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下比較 對照組即正常結膜分為上皮層和基質層。上皮層由3～5層細胞組成，表層為扁平細胞，中層為多邊形細胞，基底層為立方形或柱形細胞。基質層為疏松結締組織，其間有散在的毛細血管，少量成纖維細胞、淋巴細胞和中性粒細胞。病例組胬肉伴有上皮細胞增生，并見上皮囊腫，上皮增生變厚，厚薄不均，上皮下見較豐富的毛細血管，伴瞼裂斑改變，符合翼狀胬肉病理改變。

2.2 免疫組化 (1)病例組與對照組的VEGF:VEGF蛋白主要定位在血管內皮和細胞漿表達細胞漿呈現棕色，胞核無著色，陽性部位主要在上皮中的杯狀細胞。2組VEGF IHS數值比較:病例組IHS的平均秩次為44.60，對照組IHS的平均秩次為16.40，二者差異有統計學意義(P ＜0.01)。(2)病例組與對照組的P53:P53抗體主要在細胞核表達，呈現棕色。2組P53 IHS數值比較:病例組IHS的平均秩次為15.88，對照組IHS的平均秩次為45.12，Z 值為 －6.626，P 值為 0.001，二者差異有統計學意義(P＜0.01)。(3)病例組VEGF和P53的比較差異有統計學意義(P＜0.01)。結果顯示VEGF和P53均在翼狀胬肉中均為高表達。VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達具有一定相關性(r= －6.626，P ＜0.01)。

3 討論

翼狀胬肉形成是多因素參與的復雜病理過程，主要成分是大量增生的成纖維細胞，并由其導致相應的病變，而細胞因子在成纖維細胞增生方面起著重要的作用。有研究表明紫外線照射的增加會引起Bowman’s膜的生物學發生改變，產生刺激翼狀胬肉生長的免疫因子，最具代表性的就是血管刺激生長因子(VEGF)，可以導致大量血管和成纖維細胞的增生和退變。

翼狀胬肉是眼科常見病，翼狀胬肉的復發率高，生長相對頑固。過去被認為是一種結膜組織的變性疾病，研究表明翼狀胬肉是一組織增生性結膜疾病，其發病機制仍不十分清楚，可能與細胞異常增殖和凋亡異常有關。隨著分子生物學的發展，對翼狀胬肉的發病機制有了新的認識，VEGF是目前發現的功能最強的血管形成促進因子，它具有增強微血管的通透性，刺激內皮細胞分裂，增加組織因子和某些蛋白酶的產生等作用。VEGF不僅能特異性地刺激血管內皮細胞的有絲分裂、促進血管形成、抑制血管內皮細胞凋亡、誘導血管平滑肌細胞的遷移，能促進血管平滑肌細胞合成和分泌基質金屬蛋白酶、加速基質降解及趨發炎性細胞，同時還具有促血管通透作用，使血管內大分子物質溢出，從而有利于血管外基質的形成，為血管內皮的遷移及血管形成提供物質，最終促使新毛細血管生成并促進功能成熟［4，5］。在紫外線氧化應激引起的DNA損傷中，P53基因是最常見的被損傷的基因之一。P53基因參與細胞的DNA的修復與合成，調節細胞的分化、凋亡，控制細胞的周期，是引起人類腫瘤最常見的突變基因。P53基因產物組織細胞進入S期，參與抑制細胞增生，并促使DNA損傷的細胞進入程序化死亡。突變型P53基因可翻譯成異常P53蛋白，并在細胞內聚集胬肉組織上皮細胞胞質中P53蛋白呈陽性表達，且胬肉周圍看似正常的結膜上皮亦表達陽性，上皮下組織則為陰性。胬肉上皮細胞異常表達P53蛋白，提示胬肉上皮細胞呈增生活躍狀態。戶外工作者的P53蛋白表達明顯增多，提示紫外線可引起P53蛋白的異常表達［6］。本研究應用免疫組化學染色，翼狀胬肉患者標本P53蛋白表達陽性，而正常結膜均為陰性。有研究認為P53基因是十分重要的腫瘤抑制基因，其與細胞的生長、分化關系密切，50%的腫瘤組織P53蛋白表達增加［7］，一些癌前期病變及良性增生性組織也表達P53蛋白［8］。翼狀胬肉上皮細胞異常表達P53蛋白提示翼狀胬肉上皮細胞的生物學特征不同于正常結膜，其上皮細胞呈增生活躍狀態。以往對翼狀胬肉的研究表明，其上皮下成纖維細胞增生活躍，結合本試驗結果，我們認為翼狀胬肉應為一種良性增生性疾病。

組織學上，翼狀胬肉是由萎縮的結膜上皮和增生肥大的血管化組織及彈性退變結締組織構成。近年來的研究表明，翼狀胬肉更趨向是一種組織增生性疾病，并可能與細胞的增殖與凋亡有關。翼狀胬肉組織超微結構研究表明，彈性纖維與膠原纖維的增生和變性是翼狀胬肉較為突出的病理改變，臨床表現為新生的組織不斷生長、增厚，并逐漸侵入角膜，手術切除后易復發，此特點與腫瘤組織相似，而腫瘤發生發展的重要原因是細胞異常增殖和凋亡失衡［9－11］。

我們研究與翼狀胬肉發生發展相關的細胞因子，為預防和控制翼狀胬肉的發生發展提供理論依據，為生物科技研制相關治療翼狀胬肉的試劑提供一定的幫助，同時為相關職業的職業病的防護提供臨床干預方法。通過對VEGF和P53在翼狀胬肉中的表達及相關性研究，為研究翼狀胬肉的發病機制提供理論依據;選擇性的VEGF和P53拮抗藥物可以有效減少翼狀胬肉的發生，為臨床藥物研究提供理論支持。

盡管研究顯示有很多相關環境因素造成翼狀胬肉的發生發展，但是翼狀胬肉的發病記住仍不十分清楚，研制臨床藥物需要多種因子的拮抗劑及多種因子的協同劑，還需要大量的臨床藥物試驗，今后仍需要大樣本的、前瞻性的隊列研究，以便更為深入的揭示其發病機制。

1 馬科，徐亮，張士元，等.北京特定地區翼狀胬肉患病率的流行病學調查.中華眼科雜志，2005，41:63-64.

2 閻啟昌，劉忠鑫，邸悅，等.三亞地區翼狀胬肉發病與紫外線暴露時間相關關系研究.中華醫學雜志，2006，119:1308-1310.

3 Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox-2 is expressed in humanpulmonary，colonic，and mammary tumors.Cancer，2000，89:2637-2645.

4 張濤，李紅兵，慕玉東.VEGF的生物活性及其在心血管疾病中的應用.遼寧醫學雜志，2006，20:27-28.

5 Gebhardt M，Mentlein R，Schaudig U，et al.Differential expression of vascular endothelial growth factor implies-the-limbalorigin-of-pterygia.Ophthalmology，2005，112:1023-1030.

6 Tan DT，Tang WY，Liu YP，et al.Apoptosis related gene expression in normal conjunctive and pterygium.Br J Ophthalmol，2000，84:212-216.

7 伍新堯，羅權超，楊英浩主編.基因診斷原理與臨床.第1版.廣州:中山大學出版社，1995.114.

8 Moss SF.REVIEWARTICLE:celllularmarkersinthegastricprecancerous process Alimen Pharmacol.THER，1998，12 Suppll:91-109.

9 Tsai YY，Chang KC，Lin CL，et al.p53 Exp ression in pterygium by immunohistochemical analysis:a series report of 127 cases and review of the literatue.Cornea，2005，24:583-586.

10 王勇，張明昌，胡義珍.細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27kip1在翼狀胬肉中的表達.眼科新進展，2005，25:52-53.

11 Park TK，Jin KH.Telomerase activity in p terygeal and normal conjonctival epithelium.Korean J Ophthalmol，2000，14:85-89.