4,9-二[N-(2-二甲氨基)乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺與蛋白質相互作用

張麗娟

(福建生物工程職業技術學院藥學系，福建 福州 350002)

有關蛋白質的研究是目前生命科學和化學領域中一個十分活躍的課題[1-2]。尋找新的、無毒害無污染、發光強度高和選擇性強的熒光探針則是目前國內外對蛋白質研究的重要方向。吖啶-4-酰胺衍生物探針在國內外的應用研究較少，開展這方面的研究對于拓展吖啶類熒光探針的應用范圍，開發性能更優良的生物大分子熒光探針具有重要意義。在9-氯吖啶-4-甲酰氯的基礎上，同時在4位、9位上引入2個N-(2-二甲氨乙基)取代基，合成了具有生物活性的4,9-二[N-(2-二甲氨基)乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺(簡寫DNAF)。DNAF做為一種新的熒光探針，具有良好親水性和熒光產率；此外，其不含氨基羧基等酸堿基團，在酸性體系中，2個N-(2-二甲氨乙基)取代基具有更高的正電荷，環境酸堿度變化對其影響降低。

探索了DNAF對蛋白質內源熒光猝滅的猝滅機制，并通過熒光猝滅試驗，研究了DNAF與牛血清白蛋白(簡寫BSA)的結合作用機理。

1　儀器與試劑

Varian Cary Eclipse 熒光光譜儀(美國VARIAN)；Perkin-Elmer Lambda 800 紫外-可見分光光度計(美國)；PHS-3C型酸度計(上海大普儀器有限公司)。

DNAF由實驗室自制，配成3.0×10-4mol/L和1.5×10-4mol/L的儲備液，4 ℃條件下避光保存；牛血清白蛋白(BSA)(Sanland-chem Internation Inc.)配成含0.1 mol/L NaCl的1.0×10-4mol/L的儲備液，存于4 ℃避光條件下；Tris-HCl 緩沖溶液(pH值為7.0)。所用試劑均為生化純與分析純，試驗用水均為二次去離子水。

2　試驗方法

在一系列5 mL刻度試管中加入pH值為7.0的Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL，0.5 mL BSA(1.0×10-4mol/L)溶液，不同體積的DNAF(3.0×10-4mol/L)溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，分別在不同溫度下，測定BSA的熒光光譜。激發波長280 nm，發射波長290～500 nm，狹縫寬度均為5 nm。

3　結果與討論

3.1　DNAF對BSA熒光猝滅的機理

為了闡明給體BSA的猝滅機理，固定c(BSA) 為1.0×10-5mol/L,λex為280 nm，pH值為7.0，分別在12、24和36 ℃下，測定DNAF-BSA體系的熒光光譜。以F0/F為縱坐標，c為橫坐標作Stern-Volmer圖，見圖1。以(F0-F)-1為縱坐標，c-1為橫坐標作Lineweaver-Burk圖，見圖2。

圖1　不同溫度條件下BSA與DNAF作用的Stern-Volmer曲線Fig.1　The Stern-Volmer curves of BSA quenched by DNAF at different temperature

由圖1可以看出，隨著溫度的上升，BSA猝滅曲線斜率降低，初步判斷可能為靜態猝滅。

圖2　不同溫度條件下BSA-DNAF作用Lineweaver-Burk曲線Fig.2　The Lineweaver-Burk curves of BSA-DNAF at different temperature

為了進一步證實此猝滅過程，利用方程式(1)，將此過程按動態猝滅過程處理。

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

式中，F0、F分別為猝滅劑不存在、存在時的熒光強度；Kq為雙分子猝滅過程速率常數，L/(mol·s)；Ksv為動態猝滅常數，L/mol；τ0為猝滅劑不存在時熒光分子平均壽命，s；[Q]為猝滅劑濃度，mol/L。

熒光分子的平均壽命τ0約為10-8s[3]，故由猝滅曲線斜率可求得12、24和36 ℃時Kq見表1。

由表1可知，Kq值大于各類猝滅劑對分子的最大擴散碰撞猝滅常數2.0×1010L/(mol·s)[4]，因此原假設不成立，猝滅不是由動態猝滅過程引起的，而是靜態猝滅過程。利用靜態猝滅公式(2)：

表1　BSA與DNAF在不同溫度條件下作用的結果[按式(1)]Table 1　Experiment results of BSA quenched by DNAF at different temperature(according to eq(1))

1/(F0-F)=1/F0+KD/F0[Q]

(2)

作不同溫度下的Lineweaver-Burk曲線(見圖2)，由直線斜率求得BSA與DNAF在12、24和36 ℃時的解離常數KD，結果見表2。

表2　BSA與DNAF在不同溫度條件下作用的結果[按式(2)]Table 2　Experiment results of BSA quenched by DNAF at different temperature(according to eq(2))

由表2可見溫度對猝滅的影響不大，說明BSA與DNAF有較強的結合。

3.2　DNAF與BSA作用的結合常數和結合位點數

圖3為15 ℃時在牛血清白蛋白溶液體系中，隨著DNAF濃度的增加，BSA的熒光猝滅譜圖。343 nm處為BSA的熒光猝滅情況，451 nm處為在BSA作用下的不同濃度的DNAF的熒光增強情況，c(DNAF)從1到9對應的濃度分別為0、0.4×10-5、0.8×10-5、1.2×10-5、1.6×10-5、2.0×10-5、2.4×10-5、2.8×10-5和3.2×10-5mol/L，c(BSA)為1.0×10-5mol/L。

圖3　溶液中BSA與DNAF相互作用的熒光光譜Fig. 3　Fluorescence spectra of interaction between BSA and DNAF in aqueous solution

(3)

由343 nm處的試驗數據進一步應用公式(3)處理，得到圖4。

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圖4　lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖Fig.4　The plot of lg[(F0-F)/F] versus lg[Q]

從圖4可以看出，在DNAF由低到高的整個濃度范圍都呈現良好的線性，與公式(3)吻合良好，表明這一過程屬于靜態猝滅過程。由所得的直線求算出DNAF與BSA結合時的結合常數KA=5.46×103，結合位點數n為0.98。可見DNAF與BSA可發生相互作用，且結合作用較強。

3.3　DNAF與蛋白質的主要結合力的確定

在(24±2) ℃下測定BSA的熒光光譜，當溫度變化不大時，反應焓變可以看作是一個常數。根據公式(4)和(5)：

ln (KA2/KA1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R

(4)

ΔG=-RTlnKA=ΔH-TΔS

(5)

可求出24 ℃時DNAF焓變ΔH為-30.35 kJ/mol；熵變ΔS為-30.77 J/(mol·K)；反應自由能變ΔG為-21.21 kJ/mol。由于ΔH<0，ΔS<0，根據熱力學參數與作用力的關系，可知DNAF與BSA結合的作用力類型主要是氫鍵與范德華力。

3.4　BSA與DNAF間的能量轉移和結合距離

在一系列5 mL刻度試管中加入pH值為7.0的 Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL，空白組加入0.5 mL的BSA(1.0×10-4mol/L)溶液，對照組加入0.5 mL的BSA(1.0×10-4mol/L)溶液及0.33 mL的DNAF(1.5×10-4mol/L)溶液，使二者物質的量之比為1:1。用水稀釋至刻度，搖勻，在15 ℃下測定空白組和對照組的熒光光譜，測定對照組的紫外吸收光譜。

通過上述的試驗中測定猝滅速率常數的結果，在廣泛的溫度范圍內猝滅速率常數Kq值處于1011L/(mol·s)數量級。圖5為n(BSA):n(DNAF)為1:1，c(BSA)為1.0×10-5mol/L,c(DNAF)為1.0×10-5mol/L時體系的吸收譜和相同濃度的BSA的熒光發射譜的重疊光譜圖。

圖5　熒光發射光譜與紫外吸收光譜的譜圖重疊Fig.5　Overlap of the fluorescence emission spectra and absorption spectra

BSA的吸收光譜與發射光譜有相當重疊面積，求得該圖中光譜重疊部分(285～500 nm)的積分面積J為9.73×10-14(cm3·L)/mol，初步判定為遵循F?rster非輻射能量轉移機制[5]。BSA分子中在134和212位處有2個色氨酸殘基，BSA熒光(λem=335 nm)主要來自于第212位的色氨酸殘基。在上述試驗條件下，偶極空間取向因子K2可取受供能體各向隨機分布的平均值2/3[6]，供能體熒光量子產率Φ通常取蛋白質中色氨酸的量子產率0.118[7]，介質折射指數N一般取水和有機物折射指數的平均值1.336[8]。據公式(6)和(7)，可計算相關信息。

式中，R0為臨界距離，nm；K2為偶極空間取向因子；N為介質的折射指數；Φ為授體的光量子效率；J為授體(蛋白質)熒光發射光譜與受體(染料)吸收光譜間的光譜重疊積分，cm3·L/mol；E為能量轉移效率；r為授體-受體間距離，nm。

分別求得臨界距離R0為3.58 nm；能量轉移效率E為0.12；從而求出BSA中第212位色氨酸殘基與DNAF分子間的距離r為4.99 nm。

4　結論

利用合成的一種新型的蛋白質分子熒光探針DNAF，對其與BSA的相互作用進行了研究。得知DNAF對BSA的熒光猝滅為靜態猝滅機制，測定了相應的熱力學參數ΔH為-30.35 kJ/mol，ΔG為-21.21 kJ/mol，ΔS為-30.77 J/(mol·K)，結合位點數n為0.98及表觀結合常數KA為5.46×103，計算了供體BSA和受體DNAF的距離r為4.99 nm，能量轉移效率E為0.12。證明氫鍵作用和范德華力對兩者結合起到重要作用，DNAF與BSA的能量轉移機制符合F?rster非輻射能量轉移理論。

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