電針對非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清及肝組織SOD和MDA的影響

程井軍(湖北中醫藥大學針灸基礎教研室，湖北 武漢430061）

李德順(湖北中醫藥大學方劑學教研室，湖北 武漢430061）

馬 駿，沈 峰(湖北中醫藥大學針灸學教研室，湖北 武漢430061）

齊鳳軍(湖北中醫藥大學推拿學教研室，湖北 武漢430061）

孫國杰(湖北中醫藥大學針灸學教研室，湖北 武漢430061）

非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）與肥胖、高脂血癥和糖尿病高度相關[1]，但其發病機制不明。我們應用電針刺激SD大鼠肝俞、足三里、豐隆、太沖，觀察電針對高脂飲食所致的非酒精性脂肪性肝炎(NASH）大鼠血清及肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD）和丙二醛(malondialdehyde，MDA）的影響，為臨床治療非酒精性脂肪性肝炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料

SPF級雄性SD大鼠(南方醫科大學動物實驗中心，批號2004A068）40只，體質量(190±20）g；上海產G-6805針灸治療儀；熊去氧膽酸片(UDCA，成都市湔江制藥廠）；血清超氧化物歧化酶和丙二醛試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1．2 方法

1．2．1 動物分組與模型建立 選用SPF級雄性SD大鼠40只，采用清潔級架式分籠飼養。所有大鼠均正常喂養1周，再隨機分為4組。正常對照組10只，普通飼料喂養；模型組10只，電針組10只，藥物組10只，均采用高脂飼料喂養。實驗依據范建高經典造模方法[2]，自由攝食和飲水，飼料和水每日更換1次。針刺組取穴參照全國協編 《動物實驗針灸學》標準穴位圖譜定肝俞、足三里、豐隆、太沖，電針治療，選用0．5寸長毫針(1cm）電針穴位，上海產G-6805針灸治療儀(疏密波8～80Hz，疏密波轉換14次／min，電壓1．5V，強度1mA）通電治療20min，自第12周開始每天治療1次，連續6d后休息1d，共治療4周。藥物組自第12周開始每天以西藥UDCA 250mg／（kg·d）的水溶液為唯一飲料，繼前高脂食物喂養共4周。正常組和模型對照組不進行電針和藥物治療，喂養共16周。各組在16周后隔夜空腹以2%戊巴比妥鈉麻醉，經下腔靜脈采血，并頸椎脫臼處死動物，摘取肝臟。

1．2．2 觀察項目與測定方法

1）一般情況。觀察動物體質量(分別于實驗前至第16周末用電子秤稱量各組大鼠的體質量）、食欲、行為、狀態、毛發及死亡情況，計算肝指數(肝臟濕質量／體質量×100%）。

2）血清ALT、AST測定。檢測血清ALT、AST采用Olympus Au560全自動生化分析儀測定。

3）血清SOD、MDA含量測定。分別采用鄰苯三酚自氧化抑制法、硫代巴比妥熒光法測定血清SOD、MDA含量。

4）肝組織SOD、MDA含量測定。按試劑盒操作說明用生物化學法分別測定SOD、MDA含量。

5）肝組織病理變化觀察。將肝組織用4℃生理鹽水沖洗，在肝臟最大葉距邊緣5mm處取小塊肝組織，中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織普通病理變化。

1．3 統計學分析

應用SPSS11．0軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，兩樣本均數的比較采用t檢驗，等級資料采用秩和檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 各組大鼠一般情況變化

實驗結束時模型組和西藥組分別有2只和1只動物因相互撕咬而死亡，模型組大鼠體質量增長最迅速，食欲好，且動物性情較溫順，活動減少；第13～16周，電針組體質量增加明顯減慢。體質量及肝指數模型組比正常組顯著增高(P＜0．01）；模型組比電針組顯著增高(P＜0．01）；西藥組較之電針組增高(P＜0．05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量、肝指數的變化

2．2 各組大鼠肝功能比較

模型組比正常組顯著增高(P＜0．01）；模型組比電針組顯著增高(P＜0．01）；電針組較之西藥組有下降趨勢，但兩者比較無明顯差異(P＞0．05）。見表2。

表2 各組大鼠肝功能比較

2．3 各組大鼠血清SOD活性、MDA含量的變化

模型組血清MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢，有統計學差異(P＜0．05）；而SOD活性有下降趨勢，但無統計學差異（P＞0．05）。見表3。

2．4 各組大鼠肝勻漿SOD活性、MDA含量的變化

模型組肝組織MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢，有統計學差異(P＜0．05）；而SOD活性亦有下降趨勢，但無統計學差異(P＞0．05）。見表4。

表3 各組大鼠16周時血清MDA含量、SOD活性比較

表4 各組大鼠16周時肝組織MDA含量、SOD活性比較

2．5 各組大鼠肝臟組織病理學檢查

2．5．1 肝臟外觀形態觀察 正常組肝臟外觀呈鮮紅色，質地軟而富有彈性；模型組肝臟體積呈均勻性增大，邊緣銳利，表面光滑，質軟。表面及切面呈黃紅色，有油膩感。電針組及西藥組肉眼觀察差別不明顯，色澤較暗，質地、彈性均介于模型組和正常組之間。

2．5．2 光鏡下肝臟病理學改變 正常組大鼠肝細胞形態排列正常，肝小葉清晰規則，細胞質均勻，偶見小泡性脂肪滴空泡；模型組所有大鼠均出現程度不等的彌漫性肝細胞濁腫、脂肪變性，脂變肝細胞體積增大，細胞質內可見數量不等、大小不一的脂肪空泡，胞核被推向周邊；肝組織均存在小葉內炎癥，大部分組織可見匯管區炎癥，且出現肝細胞點、片狀壞死(見圖1）。電針組肝組織脂肪變程度明顯減輕，肝細胞形態趨于正常(見圖2）。西藥組病理學改變介于模型組和電針組之間。

圖1 模型組大鼠肝細胞光鏡下形態(HE，×400）

圖2 電針組大鼠肝細胞光鏡下形態(HE，×100）

3 討 論

由單純的脂肪肝發展至NASH，氧化應激或肝中氧化抗氧化平衡失調，可能是其重要機制。線粒體是氧化應激和活性氧簇(ROS）產生的最大來源[3-4]。肝內過多的FFA，特別是多不飽和脂肪酸，可損害細胞生物膜及線粒體呼吸鏈，使線粒體的改變和呼吸鏈功能不全，從而使脂肪酸β氧化及肝氧化增加，不平衡的氧化磷酸化導致自由基形成[5]；氧化應激還與FFA誘導CYPⅡE1和CYP4A表達增強相關。臨床和實驗表明，CYPⅡE1在脂肪性肝病中表達增強[6]。CYPⅡE1具有很強的氧化活性，是ROS的重要來源。高表達的CYPⅡE1在氧化基質的同時，釋放大量的ROS和自由基。過多的ROS和自由基耗竭谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等抗氧化因子，使促氧化物與抗氧化物之間的動態平衡失調，即出現氧化應激狀態。

氧化應激通過多種途徑促成肝損害：進一步影響呼吸鏈[7-8]，直接或間接氧化損害線粒體基因組，導致更多的ROS產生，如此惡性循環；降低肝谷胱甘肽水平，增加解偶聯蛋白-2（UCP-2）的表達，導致ATP耗竭，降低肝細胞的應激能力[9]；使脂質過氧化，產生大量具有反應活性和細胞毒性的中間產物，導致細胞死亡、壞死，并通過細胞損傷產生炎癥反應或吸引炎癥細胞浸潤肝實質[10]。此外，脂質過氧化還釋放MDA和4-羥基己酸，能刺激Ito細胞核合成膠原，導致纖維化。4-羥基己酸能趨化中性粒細胞，導致炎癥細胞浸潤，MDA能使包括細胞骨架蛋白在內的蛋白質發生交聯，形成Mallory小體[11]；提高幾種CKs（TNF-alpha，TGF-beta）的表達，在細胞死亡、炎癥反應和纖維化中發揮關鍵作用[12-13]。

針灸對脂質過氧化有重要影響。倫新等[13]取足三里、關元穴，對老年人實行隔姜灸，結果體內血SOD活性明顯升高。孔立紅等[14]取單側肺俞、脾俞、腎俞穴，對糖尿病大鼠進行針灸，結果能明顯提高大鼠血清SOD的活性。趙立榮等[15]取內關、太沖，可提高小鼠腦組織CAT活性。另外，孫忠人等[16]研究發現，針刺足三里穴能顯著降低老齡小鼠血清和肝組織中MDA水平。

本實驗證實：模型組肝組織MDA顯著高于正常組(P＜0．05），SOD活性顯著低于正常組(P＜0．05）；電針組與模型組比較，MDA含量顯著降低(P＜0．05），而SOD活性明顯升高(P＜0．05）；電針組與藥物組比較，MDA含量有下降趨勢，有統計學差異(P＜0．05）；而SOD活性有下降趨勢，但無統計學差異(P＞0．05）。結果提示，電針能夠提高肝組織抗氧化能力，減輕脂質過氧化，可能是其防治NASH的主要機制之一。

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