食用真菌喂養大鼠血漿抗氧化活性的測定

遼寧衛生職業技術學院生物技術系(110101) 張中林 鄭劍玲 齊 賀

遼 寧 中 醫 藥 大 學 孫宏偉

超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽過氧化物酶(GSH-Px)是兩種重要的生物氧化保護酶。SOD有銅-鋅-SOD、錳-SOD和鐵-SOD3種。它是清除和抗氧化最重要的金屬酶[1]。SOD能將組織細胞中的氧自由基通過歧化反應生成過氧化氫和氧分子,從而減少氧自由基對細胞的損傷;GSH-Px是細胞內抗脂質過氧化的酶活性保護系統中的重要成員之一,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用。近年來,一些學者開始合成或從天然植物中尋找具有清除氧自由基效能的有效成分,已取得很大的進展[2]。國內已有關于真菌菌絲及子實體中 SOD檢測的報道[3-4]。本實驗以新鮮的食用真菌為材料,喂養大鼠觀察其血漿中 SOD和 GSH-Px活性改變。

1 材 料

1.1 動物和樣品 選取成年大鼠 36只,體重為 190～240g,由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供,動物合格證號：SCXK(京)2004-0001,隨機分為 3組,分別為香菇真菌組、金針菇真菌組及對照組,每組各12只,雌雄各半,分圈飼養,飲去離子水,自由進食。香菇真菌粉和金針菇真菌粉由遼寧省農科院食用真菌研究所提供。實驗時分別稱取樣品各 5g,用純凈水配成 50m L的樣液,每只灌胃 4m L/100g體重給受試動物。每周稱重,給樣量根據每周體重增減調整,實驗時間為 40天。

1.2 藥物與試劑 鄰苯三酚：白色粉末,甌海化工試劑廠。無水乙醇：分析純,沈陽第一試劑廠。氯仿：分析純,天津化學試劑廠。50mmol/L Tris-HCL緩沖液pH 8.0。還原型谷胱甘肽(GSH)：上?；瘜W試劑廠。 H2O2：天津市化工廠。5,5'-二巰基-2,2'-二硝基苯甲酸(DTNB)：黃色粉末,英國。

1.3 儀器 自動記錄分光光度計(日本 Shimadzu,UV-265)。離心機(北京醫用離心機廠,LD4-2A)。電熱恒溫三用水箱(北京永光明醫療儀器)。

2 方 法

2.1 制備血漿 稱體重,用 1%戊巴比妥進行腹腔麻醉(0.4m L/100g體重),開腹,腹主動脈采血,肝素抗凝,4℃冷藏。

2.2 血漿超氧化物歧化酶活性的測定

2.2.1 鄰苯三酚自氧化速率的測定 SOD活性(Marland法 )[5],取 3m L的 50mmol/L Tris-HCL,pH 8.0緩沖液做空白,用 UV-265島津自動記錄分光光度計,調零點,再取 3mL緩沖液加入鄰苯三酚,迅速混勻,然后快速倒入 1cm紫外比色杯中,25℃恒溫池中,波長為 325 nm,在 2分鐘內連續測定其光密度值變化。計算線性范圍內每分鐘光密度值的增加(△A),即為鄰苯三酚自氧化速率(△A0)。

2.2.2 樣品血漿 SOD活性的測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定酶活性。分別取 200μL血漿,加 200μL蒸餾水,振混 1分鐘后加 100μL冷無水乙醇,再振混 1分鐘,然后加 100μL氯仿,振混 1分鐘后,以3000 rpm/min,離心 10分鐘,上清備用。測試須先加入待測血漿于適量緩沖液中,混勻后,再加入鄰苯三酚,迅速混勻,然后快速倒入 1cm紫外比色杯中,25℃恒溫池中,波長為 325nm,在 2分鐘內連續測定其光密度值變化。

2.2.3 樣品酶活性的計算 在溫度25℃,pH 8.0的條件下,檢測波長為 325nm,每 1m L反應液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達 50%的酶量,定義為1個酶活力單位 U。

其原理：鄰苯三酚在堿性條件下,能迅速自氧化,釋放出 O2-,SOD能催化發生歧化反應,生成 H2O2和 O2,從而抑制鄰苯三酚的自氧化,反應如下：2+2H→H2O2+O2樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率,即反映樣品中 SOD的含量。

2.3 GSH-Px酶活性測定 GSH-Px活性 (DTNB法[6],測定管取 GSH與上清液各 0.4mL,空白管以pH7.0磷酸緩沖液 0.4mL代替 GSH溶液。并以水代替真菌發酵液做非酶管。各管均置于 37℃預溫5分鐘,然后加入已預溫至 37℃的 H2O2溶液0.2m L,混勻并立即記錄反應開始時間,繼續保溫 5分鐘,反應完畢后,立即依次加入偏磷酸沉淀液4.0m L,使蛋白酶失活。以 3000 rpm/m in,離心 10分鐘,取出上清液 2m L,加入 Na2HPO4淀液 2mL,與DTNB試劑1.0mL混勻,迅速用 UV-265島津自動記錄分光光度計,412nm光波處測定光密度值。酶活力單位定義為：在溫度 37℃,規定 0.4mL上清液,每分鐘扣除非酶反應的 Log[GSH]降低 1為一個酶活力單位(U)。

2.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件分析處理,計量資料以(±s)表示,組間比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。

3 結 果

3組大鼠血漿中 SOD活性與 GSH-Px活性的改變(其中 7只大鼠自然死亡)。見表 1。

表1 不同食用真菌喂養大鼠血漿中SOD活性與GSH-Px活性的改變

香菇真菌喂養大鼠血漿中 SOD活性水平高于正常對照組,差異有顯著性(P＜0.05)。金針菇真菌喂養大鼠血漿中 SOD活性水平高于正常對照組,差異有顯著性(P＜0.05)。香菇真菌和金針菇真菌喂養大鼠血漿中 SOD活性差異無顯著性(P＞0.05)。

香菇真菌和金針菇真菌喂養大鼠血漿中 GSHPx酶活性與正常對照組,差異無顯著性(P＞0.05)。但 GSH-Px酶活性也有增加趨勢。

4 討 論

食用真菌類一般都是高等真菌的子實體,日常食用的有香菇真菌、金針菇真菌等多種。這些食用真菌不僅營養豐富,而且一直以其特有的食藥兼用性受到人們的青睞。國內外學者對多種來源的SOD作了大量的研究,其開發應用越來越受到重視[7]。GSH-Px在細胞抗氧化防御機制中的作用逐步受到人們關注[8]。

本次實驗用香菇真菌和金針菇真菌喂養大鼠,血漿中 SOD活性水平均高于正常對照組,差異有顯著性(P＜0.05)。香菇真菌和金針菇真菌喂養大鼠血漿中SOD活性水平差異無顯著性(P＞0.05)。香菇真菌、金針菇真菌喂養大鼠后,血漿中 SOD活性水平顯著提高,GSH-Px酶活性也有增加趨勢。目前可利用的 SOD資源主要為動物血液、細菌、高等植物以及微生物發酵產物。其中真菌以酵母菌為主,但酵母菌的去壁環節給工業化生產 SOD帶來一定困難。食用真菌比細菌或其它工程菌發酵生產SOD更易通過毒理實驗,而且不必在所有產品中嚴格分離菌絲與發酵液。

SOD是重要的生物氧化保護酶之一。其活力的提高,有益于機體抗氧化能力的提高,它能使 O-2進一步生成 H2O2,而 GSH-Px則能使 H2O2迅速清除,兩者聯合作用可有效防止組織細胞受到氧化損傷[9]。SOD是人體抗氧化機制中的重要成分,尤其表現為對氧自由基的排除上。SOD通過其優先被氧化,或修復氧化引起的損傷,從而對機體起到保護作用。實驗研究表明,氧自由基與人體衰老及多種疾病如冠心病、高血壓、老年癡呆、癌癥、白內障等疾病有密切的聯系。抑制和清除氧自由基能延緩人體衰老和死亡,因此防御氧自由基對人體的健康損害有重要的現實意義。人們應適量增加香菇和金針菇等食用真菌的攝入,因為食用真菌富含抗氧化營養素 SOD。目前,對 SOD資源的開發利用也是國內外許多生物技術開發中心的重點藥劑開發項目。本次實驗為食用真菌中的 SOD、GSH-Px開發利用資源提供實驗依據。

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[3] 陸玲,潘欣,袁生.金針菇液體培養菌絲與子實體 SOD特性比較研究[J].中國食用菌,1999,18(5)：25

[4] 郭建春,王宇光,胡新文.幾種珍貴食用和藥用真菌超氧化物歧化酶 (SOD)的研究[J].熱帶作物學報,1995,增刊

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