姜黃素誘導急性單核細胞白血病細胞凋亡的實驗研究

崔麗霞 馬占敏

（鄭州市婦幼保健院，河南鄭州450012）

姜黃素（curcumin）是從傳統中藥姜黃中提取的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗微生物等多方面藥理作用[1]。近年來，對姜黃素抗癌作用的實驗研究表明，姜黃素能抑制體內外多種腫瘤細胞的生長且對多種腫瘤細胞有明顯生長抑制和促凋亡的作用[2]，如姜黃素呈時間及濃度依賴性抑制腫瘤細胞HL-60、K562的增殖，姜黃素也可誘導人胃癌細胞BGC-823凋亡，且毒副作用小。目前應用姜黃素對急性單核細胞白血病的藥理研究鮮見報道。本實驗通過急性單核細胞白血病株THP-1，探討姜黃素對THP-1可能的作用機制，為臨床應用于白血病的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑

人白血病細胞THP-1購自中國科學院細胞庫；姜黃素購自國藥集團化學試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國Becton Dickinson Biosciences公司；RPMI1640培養基購自Gibco公司；免疫組織化學染色試劑盒購自武漢博士德；Caspase-3分光光度試劑盒購自南京凱基生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將THP-1于RPMI1640培養基37℃、5%CO2的培養箱中培養，每48～72h傳代1次，長至對數生長期。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，實驗組加入姜黃素，使其終濃度分別為1、5、10、15μmol/L，相同條件下培養24h，每個濃度均設3個復孔，同時設陰性對照組。24h后收集細胞，細胞濃度為（1×106）個/mL，4℃預冷的PBS洗滌兩次。取100μL的細胞懸液，加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL PI，混勻后室溫避光孵育上機檢測。

1.2.3 免疫組化檢測NF-κB與Caspase-3蛋白 THP-1細胞（1×106個/mL）接種于放有蓋玻片的6孔培養板，按照1.2.2加入不同濃度的姜黃素，24h后取出蓋玻片，PBS沖洗3遍，多聚甲醛固定，按SABC免疫酶標試劑盒方法進行，每個濃度重復3遍。細胞中呈現棕褐色顆粒者為陽性細胞，并采用Biosens Digital Imaging System醫學圖像分析系統進行陽性區平均光密度測量。

1.2.4 Caspase-3活性測定 按試劑盒說明用酶標儀測定A405值。

1.3 統計學處理

采用SPSS15.0統計軟件進行分析，所有原始數據均進行正態分布、方差齊性檢驗。實驗數據以（±s）表示，多樣本均數比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對THP-1細胞凋亡率的影響

流式細胞檢測結果顯示：1、5、10、15μmol/L姜黃素作用24h后的凋亡率分別為（2.341±0.221）%、（10.841±0.789）%、（18.126±0.627）%、（26.418±0.519）%；與對照組（1.233± 0.118）%相比，除1μmol/L組無顯著性（P＞0.05）外，各組差異有顯著性（P＜0.01），見圖1，表明姜黃素誘導的THP-1細胞凋亡具有量效關系。

圖1 姜黃素對k562細胞凋亡率的影響

2.2 姜黃素對THP-1細胞NF-κB與Caspase-3蛋白表達的影響

免疫組化結果顯示，1、5、10、15μmol/L的姜黃素作用24h后，NF-κB蛋白水平逐漸降低，而Caspase-3蛋白水平逐漸升高，而且統計學分析NF-κB與Caspase-3的表達量呈負相關，系數為-0.823。見表1。

表1 姜黃素處理24h后NF-κB與Caspase-3表達水平的改變（±s，n=3）

表1 姜黃素處理24h后NF-κB與Caspase-3表達水平的改變（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別 NF-κB Caspase-3對照組 188.452±2.358 110.214±5.720 1μmol/L 185.926±4.748 116.946±5.250 5μmol/L 151.662±9.216* 132.556±4.459* 10μmol/L 139.104±7.757* 149.466±5.266* 15μmol/L 126.858±3.966* 166.902±6.238*

2.3 姜黃素活化Caspase-3

1、5、10、15μmol/L姜黃素作用24h后的Caspase-3活性值分別為（0.072±0.038）%、（0.129±0.036）%、（0.179±0.055）%、（0.233±0.059）%；與對照組（0.058±0.049）%相比，除1μmol/L組無顯著性（P＞0.05）外，各組差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

急性白血病是造血系統的惡性增生性疾病，是一以異常造血細胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血細胞減少為特征的造血系統腫瘤。在我國，小兒的惡性腫瘤中以白血病發病率最高，其中急性髓細胞白血病（AML）占小兒急性白血病的20%～40%。雖然新的治療手段不斷出現，白血病的生存率有明顯提高，但復發以及耐藥仍然是臨床醫生面臨的十分棘手的問題。大量的研究提示，NF-κB參與了白血病的發生、發展，NF-κB的高表達與促進白血病細胞生長、抗凋亡、耐藥密切相關[3]，已經成為白血病治療的一個潛在靶點。

近年的研究表明，姜黃素通過調控抑癌基因、癌基因及其蛋白表達，誘導細胞周期阻滯及調控細胞凋亡信號來實現其抗腫瘤作用。Anuchapreeda等[4]發現用姜黃素可以降低耐藥腫瘤細胞中的Pgp的含量，增加化療藥物對腫瘤細胞作用的敏感性。

近來的研究發現，姜黃素抑制乳腺癌干細胞的自我更新，但不會造成已分化的細胞毒性，這使姜黃素可能成為潛在的癌癥預防劑。在姜黃素治療胰腺癌的二期臨床試驗中，病人對姜黃素耐受性良好，顯著縮小了腫瘤體積，具有良好的的生物活性[5]，因此姜黃素具有價格低、毒性小、獲取方便和良好的抗腫瘤效果等優點，已成為極受重視的一種抗腫瘤新藥。

本實驗顯示，姜黃素可有效誘導THP-1細胞凋亡，而且具有一定的量效性。免疫組織化學染色的結果也證實了姜黃素可誘導白血病細胞發生凋亡，其可能的機制是姜黃素降低了NF-κB的表達，通過阻斷NF-κB信號傳導通路而使白血病細胞凋亡增加。

Caspase-3（半胱氨酸基天冬氨酸特異性蛋白）家族成員大多數是凋亡的啟動子或效應子，在細胞凋亡中發揮著重要作用。自1992年發現第一個Caspase開始，迄今已經發現了14種。Caspase-3是凋亡過程中最重要的效應酶之一[6]，被稱為“劊子手”，一旦它被激活，通過一系列細胞內部的蛋白變化，使細胞發生凋亡。本研究中也發現姜黃素對Caspase-3蛋白表達有上調作用，并呈濃度依賴性，考慮是其誘導凋亡的機制之一。

姜黃素幾乎無任何毒副作用，作為一種食用色素和調味劑被廣泛食用，同時也用于治療各種炎癥和其它疾病，是一種具有廣泛應用前景的新藥，美國國立腫瘤所已將其列為第三代癌化學預防藥。因此，開展其抗癌作用及機理的研究有十分重要的理論意義和實用價值。

[1]Holt PR，Katz S，Kirshoff R.Curcumin therapy in inflammatory bowel disease：a pilot study[J].Dig Dis Sci，2005，50：2191-2193.

[2]Aggarwal BB，Banerjee S，Bharadwaj U，et al.Curcumin induces the degradation of cyclin E expression through ubiquitin-dependent pathway and up-regulates cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27 in multiple human tumor cell lines[J].Biochem Pharmacol，2007，73（7）：1024-1032.

[3]Karin M，Cao Y，Greten FR，et al.NF-kappaB in cancer：from in nocent bystander to major culprit[J].Nat Rev Cancer，2002，2（4）：301-310.

[4]Anuchapreeda S，Thanarattanakorn P，Sittipreechacharn S，et al.Inhibitory effect of curcumin on MDR1 gene expression in patient leukemic cells[J].Arch Pharm Res，2006，29（10）：866-873.

[5]Kakarala M，Brenner DE，Korkaya H，et al.Targeting breast stem cells with the cancer preventive compounds curcumin and piperine[J]. Breast Cancer Res Treat，2010，122（3）：777-785.

[6]Lin CL，Zhang ZX，Xu YJ，et al.Focal adhesion kinase antisense oligodeoxynucleotides inhibit human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and promote human pulmonary artery smooth muscle cells apoptosis[J].Chin Med J，2005，118（1）：20-26.