姜黃素誘導(dǎo)急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

崔麗霞 馬占敏

（鄭州市婦幼保健院，河南鄭州450012）

姜黃素（curcumin）是從傳統(tǒng)中藥姜黃中提取的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗微生物等多方面藥理作用[1]。近年來(lái)，對(duì)姜黃素抗癌作用的實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素能抑制體內(nèi)外多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有明顯生長(zhǎng)抑制和促凋亡的作用[2]，如姜黃素呈時(shí)間及濃度依賴(lài)性抑制腫瘤細(xì)胞HL-60、K562的增殖，姜黃素也可誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡，且毒副作用小。目前應(yīng)用姜黃素對(duì)急性單核細(xì)胞白血病的藥理研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)急性單核細(xì)胞白血病株THP-1，探討姜黃素對(duì)THP-1可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用于白血病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

人白血病細(xì)胞THP-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；姜黃素購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson Biosciences公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德；Caspase-3分光光度試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將THP-1于RPMI1640培養(yǎng)基37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48～72h傳代1次，長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，實(shí)驗(yàn)組加入姜黃素，使其終濃度分別為1、5、10、15μmol/L，相同條件下培養(yǎng)24h，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。24h后收集細(xì)胞，細(xì)胞濃度為（1×106）個(gè)/mL，4℃預(yù)冷的PBS洗滌兩次。取100μL的細(xì)胞懸液，加入5μL AnnexinⅤ-FITC和10μL PI，混勻后室溫避光孵育上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)NF-κB與Caspase-3蛋白 THP-1細(xì)胞（1×106個(gè)/mL）接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，按照1.2.2加入不同濃度的姜黃素，24h后取出蓋玻片，PBS沖洗3遍，多聚甲醛固定，按SABC免疫酶標(biāo)試劑盒方法進(jìn)行，每個(gè)濃度重復(fù)3遍。細(xì)胞中呈現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，并采用Biosens Digital Imaging System醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行陽(yáng)性區(qū)平均光密度測(cè)量。

1.2.4 Caspase-3活性測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明用酶標(biāo)儀測(cè)定A405值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有原始數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布、方差齊性檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示：1、5、10、15μmol/L姜黃素作用24h后的凋亡率分別為（2.341±0.221）%、（10.841±0.789）%、（18.126±0.627）%、（26.418±0.519）%；與對(duì)照組（1.233± 0.118）%相比，除1μmol/L組無(wú)顯著性（P＞0.05）外，各組差異有顯著性（P＜0.01），見(jiàn)圖1，表明姜黃素誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡具有量效關(guān)系。

圖1 姜黃素對(duì)k562細(xì)胞凋亡率的影響

2.2 姜黃素對(duì)THP-1細(xì)胞NF-κB與Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，1、5、10、15μmol/L的姜黃素作用24h后，NF-κB蛋白水平逐漸降低，而Caspase-3蛋白水平逐漸升高，而且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析NF-κB與Caspase-3的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，系數(shù)為-0.823。見(jiàn)表1。

表1 姜黃素處理24h后NF-κB與Caspase-3表達(dá)水平的改變（±s，n=3）

表1 姜黃素處理24h后NF-κB與Caspase-3表達(dá)水平的改變（±s，n=3）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別 NF-κB Caspase-3對(duì)照組 188.452±2.358 110.214±5.720 1μmol/L 185.926±4.748 116.946±5.250 5μmol/L 151.662±9.216* 132.556±4.459* 10μmol/L 139.104±7.757* 149.466±5.266* 15μmol/L 126.858±3.966* 166.902±6.238*

2.3 姜黃素活化Caspase-3

1、5、10、15μmol/L姜黃素作用24h后的Caspase-3活性值分別為（0.072±0.038）%、（0.129±0.036）%、（0.179±0.055）%、（0.233±0.059）%；與對(duì)照組（0.058±0.049）%相比，除1μmol/L組無(wú)顯著性（P＞0.05）外，各組差異有顯著性（P＜0.01）。

3 討論

急性白血病是造血系統(tǒng)的惡性增生性疾病，是一以異常造血細(xì)胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血細(xì)胞減少為特征的造血系統(tǒng)腫瘤。在我國(guó)，小兒的惡性腫瘤中以白血病發(fā)病率最高，其中急性髓細(xì)胞白血病（AML）占小兒急性白血病的20%～40%。雖然新的治療手段不斷出現(xiàn)，白血病的生存率有明顯提高，但復(fù)發(fā)以及耐藥仍然是臨床醫(yī)生面臨的十分棘手的問(wèn)題。大量的研究提示，NF-κB參與了白血病的發(fā)生、發(fā)展，NF-κB的高表達(dá)與促進(jìn)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)、抗凋亡、耐藥密切相關(guān)[3]，已經(jīng)成為白血病治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

近年的研究表明，姜黃素通過(guò)調(diào)控抑癌基因、癌基因及其蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用。Anuchapreeda等[4]發(fā)現(xiàn)用姜黃素可以降低耐藥腫瘤細(xì)胞中的Pgp的含量，增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的敏感性。

近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素抑制乳腺癌干細(xì)胞的自我更新，但不會(huì)造成已分化的細(xì)胞毒性，這使姜黃素可能成為潛在的癌癥預(yù)防劑。在姜黃素治療胰腺癌的二期臨床試驗(yàn)中，病人對(duì)姜黃素耐受性良好，顯著縮小了腫瘤體積，具有良好的的生物活性[5]，因此姜黃素具有價(jià)格低、毒性小、獲取方便和良好的抗腫瘤效果等優(yōu)點(diǎn)，已成為極受重視的一種抗腫瘤新藥。

本實(shí)驗(yàn)顯示，姜黃素可有效誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡，而且具有一定的量效性。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果也證實(shí)了姜黃素可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡，其可能的機(jī)制是姜黃素降低了NF-κB的表達(dá)，通過(guò)阻斷NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路而使白血病細(xì)胞凋亡增加。

Caspase-3（半胱氨酸基天冬氨酸特異性蛋白）家族成員大多數(shù)是凋亡的啟動(dòng)子或效應(yīng)子，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。自1992年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)Caspase開(kāi)始，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14種。Caspase-3是凋亡過(guò)程中最重要的效應(yīng)酶之一[6]，被稱(chēng)為“劊子手”，一旦它被激活，通過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)部的蛋白變化，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究中也發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)Caspase-3蛋白表達(dá)有上調(diào)作用，并呈濃度依賴(lài)性，考慮是其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制之一。

姜黃素幾乎無(wú)任何毒副作用，作為一種食用色素和調(diào)味劑被廣泛食用，同時(shí)也用于治療各種炎癥和其它疾病，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的新藥，美國(guó)國(guó)立腫瘤所已將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥。因此，開(kāi)展其抗癌作用及機(jī)理的研究有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

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[2]Aggarwal BB，Banerjee S，Bharadwaj U，et al.Curcumin induces the degradation of cyclin E expression through ubiquitin-dependent pathway and up-regulates cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27 in multiple human tumor cell lines[J].Biochem Pharmacol，2007，73（7）：1024-1032.

[3]Karin M，Cao Y，Greten FR，et al.NF-kappaB in cancer：from in nocent bystander to major culprit[J].Nat Rev Cancer，2002，2（4）：301-310.

[4]Anuchapreeda S，Thanarattanakorn P，Sittipreechacharn S，et al.Inhibitory effect of curcumin on MDR1 gene expression in patient leukemic cells[J].Arch Pharm Res，2006，29（10）：866-873.

[5]Kakarala M，Brenner DE，Korkaya H，et al.Targeting breast stem cells with the cancer preventive compounds curcumin and piperine[J]. Breast Cancer Res Treat，2010，122（3）：777-785.

[6]Lin CL，Zhang ZX，Xu YJ，et al.Focal adhesion kinase antisense oligodeoxynucleotides inhibit human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and promote human pulmonary artery smooth muscle cells apoptosis[J].Chin Med J，2005，118（1）：20-26.