蟲草素對胰腺癌BxPc-3、BxPc3-LN5細胞株增殖抑制作用的研究*

許文彥 龍江 唐亮 吳明生 張倩 倪泉興 虞先濬

（1.復旦大學附屬腫瘤醫院，上海200032；2.上海國寶企業發展中心，上海200001）

胰腺癌是一種較常見的惡性腫瘤。在我國胰腺癌的發病率也有逐年增多趨勢，90%的患者在診斷后1年內死亡，1年生存率僅為1%～3%。藥物治療是重要的治療手段之一，它能明顯延長患者的生存時間，提高患者的生存質量。蟲草素即3-脫氧腺苷（3-deoxyadenosine），為含氮配糖體的核酸衍生物，屬嘌呤類生物堿，是一種核苷類抗生素，最早由Cunningham于1951年在蛹蟲草（Cordyceps militaris）原漿液中分離得到，該成分后被證實為我國中草藥冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）的有效成分[1]。分子式為C10H13N5O3，相對分子質量為251，熔點為230～231℃，溶于水、熱乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿，紫外光的最大吸收波長為259nm[2]。研究證明蟲草素能抑制mRNA合成，誘導腫瘤細胞凋亡[3]，使細胞分化，從而對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用[4-9]。本文采用四甲基噻唑藍比色法（MTT比色法）研究蟲草素對胰腺癌細胞株BxPc3、BxPc3-LN5的生長抑制作用，為蟲草素是否可用于胰腺癌臨床化療進行理論探討。

1 材料與方法

1.1 細胞

人胰腺癌細胞株BxPc3購買自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫中心。BxPc3-LN5是人原位胰腺腺癌細胞BxPc3在裸鼠體內多次細胞注射成瘤后取裸鼠轉移淋巴結原代培養所得。所有細胞株在含有10%胎牛血清的RPMI Medium 1640（RPMI 1640）+Dulbecco’s modified Eagle Medium（DMEM）各半的培養基中（pH7.2），并置于37℃、飽和濕度和5%CO2孵育箱內培養傳代。

1.2 藥物

四甲基噻唑藍（MTT）、DMSO購買自Sigma公司；RPMI1640培養基、血清購自Hyclone公司；蟲草素來自上海國寶企業發展中心，純度為99.9%。

1.3 細胞培養

將凍存的人胰腺癌細胞株BxPc3、BxPc3-LN5從液氮罐中取出。細胞常規復蘇及傳代。取對數生長期的BxPc3、BxPc3-LN5細胞株，配制成1×107/mL單細胞懸液，接種于96孔培養板，每孔0.1mL。

1.4 MTT檢測

實驗組分別加入蟲草素至培養孔中，質量濃度為10、20、40、80、160μg/mL，每個藥物質量濃度設6個復孔，空白對照組不加藥，置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下常規培養24h及48h，每孔加入20μL MTT（5mg/mL），再置培養箱內繼續培養4h。吸棄上清液，每孔加入100μL DMSO振蕩5min，用酶聯儀（瑞士Tecan公司、Sunrise酶標儀）在492nm波長下測定各孔光吸收值（OD值），記錄結果。細胞抑制率計算公式為：細胞抑制率=（空白對照組OD均值-藥物組OD均值）/空白對照組OD均值× 100%。

1.5 統計學處理

用SPSS11.0軟件進行方差分析。

2 結果

本次MTT實驗顯示，蟲草素對于胰腺癌BxPc3以及淋巴轉移胰腺癌BxPc3-LN5細胞株均具有一定的細胞毒效應。且細胞生長的抑制率都隨著藥物作用時間的延長及藥物質量濃度的升高而增加。比較各組濃度的蟲草素對于兩株細胞在24h和48h末所產生的細胞抑制率，發現無論是BxPc3或是BxPc3-LN5，在48h末的細胞抑制率均高于其在24h末的抑制率。見圖1，2。可以認為蟲草素對于胰腺癌BxPc3、BxPc3-LN5細胞株的細胞抑制作用呈時間依賴性。

而比較兩株細胞分別于24h與48h在不同濃度的蟲草素作用時的細胞抑制率，發現隨著蟲草素劑量的升高，細胞的抑制率也隨著上升，呈現一個明顯的劑量依賴性。見圖3～6。

比較蟲草素對于兩株細胞的作用差別可以發現，無論在24h末或48h末，蟲草素對于BxPc3細胞株的抑制作用均要略好于BxPc3-LN5細胞株。見圖7，8。可能是因為BxPc3-LN5細胞株屬于高轉移潛能細胞株，其對于抗腫瘤藥物的耐藥性要高于原代細胞株。

3 討論

近年來，盡管胰腺癌分子水平研究取得了顯著進步，但5年生存率仍沒有顯著提高，較晚出現的臨床癥狀、較低的手術切除率、較高的術后復發率以及對放化療不敏感是造成這一狀況的主要原因[10，11]。在胰腺癌的治療方面，除了傳統的手術、放療與化療，又出現了基因干擾和靶向治療，使胰腺癌的防治工作有了突破性進展。同時應用中藥進行綜合調節治療胰腺癌也成為近年研究的熱點領域，中藥復方或單味中藥提取的有效成分在抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和誘導腫瘤細胞分化，促進凋亡以及逆轉腫瘤細胞多藥耐藥、減毒增效等方面也有其獨到的優勢。

近年來研究發現，從中藥中提取的一些生物堿類物質在腫瘤防治方面具有重要作用，如從紫唐松草和唐松草等的根中分離得到的唐松草堿和厚果唐松次堿對W256有顯著的抑制作用，國外已進入臨床研究[12]。從山豆根中提取的異喹啉類生物堿（蝙蝠葛堿）和從胡椒果實中分離的主要生物堿（胡椒堿）對CNE-1、CNE-2Z鼻咽癌細胞株的生長增殖均有抑制作用，并呈時間依賴性抑制[13]。

早在20世紀70年代就已發現蟲草素具有抗腫瘤作用。目前現有的體內及體外實驗認為蟲草素抗腫瘤的機制是多方面的，主要是抑制DNA、RNA、蛋白質的合成，降低c-myc基因的mRNA表達，并可增強放療及某些化療藥物的敏感性；并因其半衰期短，可聯合腺苷脫氨酶抑制劑或羥基脲增加療效；同時其可增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷力，有免疫調節的作用。

蟲草素已被證實對艾氏腹水癌、人鼻咽癌KB細胞和人宮頸癌HeLa細胞等皆具有明顯的抑制作用[14，15]，對KB細胞的最低致毒質量濃度為（10～25）g/mL。Nakamura等[16]報道，蟲草素通過激發腫瘤細胞中腺嘌呤核苷A3受體，可以抑制小鼠B16-BL6黑素瘤細胞和Lewis肺癌細胞的生長。但在胰腺癌方面，國內外未見報道。本研究結果顯示，蟲草素可以抑制胰腺癌BxPC3細胞株及其高轉移潛能細胞株BxPC3-LN5的增殖。

根據藥物量效反應曲線（dose-response curve），大多數抗癌藥物在一定范圍內其細胞殺傷作用有濃度依賴性，局部（準確地說是細胞內）藥物濃度增加一倍殺滅細胞數可增加10倍左右[17]。本次MTT比色法結果顯示，胰腺癌BxPc3、BxPc3-LN5細胞株對蟲草素的作用都有較強的敏感性，隨著蟲草素濃度的增加以及作用時間的延長，細胞增殖抑制率出現明顯增加。表明蟲草素及其水提物對BxPc3及BxPc3-LN5的細胞毒作用在一定范圍內呈劑量和時間依賴關系。目前，國內尚未見應用蟲草素進行胰腺癌治療的實驗研究。我們本次實驗發現，它具有明顯抑制胰腺癌細胞株增殖的作用，顯示出良好的對抗胰腺癌細胞效應，但蟲草素產生的治療胰腺癌的生物學效應的機制還有待進一步研究。

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