肝癌特異性啟動子調控的雙靶位慢病毒載體的構建、鑒定及其在肝癌基因治療中的應用*

徐震 牛堅 劉斌

（1.徐州醫學院研究生院，江蘇徐州221002；2.徐州醫學院附屬醫院普外科，江蘇徐州221006）

基因治療是一種新的治療腫瘤的方法，其難點是效益基因在腫瘤細胞中的靶向性及其高效表達。而survivin基因在成人正常細胞中不表達，在肝癌細胞中表達其啟動子具有良好的靶向性。胰島素樣生長因子1類受體表達與腫瘤發生關系密切。

本實驗通過構建AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R慢病毒，探討其對肝癌細胞生物學行為影響，為肝癌基因治療拓展新的思路。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人 IGF1R多克隆抗體：Sant Cruze公司；Lipofectamin2000：Invitrogen公司；限制性內切酶ScaI、ClaⅠ、SpeI、PmeI、XhoⅠ、EcoRⅠ、ApaI和 NheI，T4 DNA連接酶，購于大連寶生物公司；CCK-8試劑盒：DOJINDO公司；質粒提取試劑盒、回收試劑盒購于上海生物工程有限公司；PCR引物和其他試劑購于博亞公司。

1.2 主要材料

1.3 包膜質粒pMD2G-anti-AFP-scFv質粒的構建

以表達anti-AFP-scFv的質粒pMON-scFv為模板，設計兩端含SacⅠ和ClaⅠ的酶切位點的引物。

將anti-AFP-scFv基因片段插入包膜質粒pMD2G的SacⅠ和ClaⅠ位點，構建pMD2G-anti-AFP-scFv質粒。

1.4 穿梭質粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的構建

從NCBI里找到人IGF1R基因的cDNA序列全長，genbank號為NM_00875。利用網上的設計工具（genesil等）進行siRNA片段的篩選，將選出合適的目標序列進行合成，并引入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位點。

形成穿梭質粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。酶切電泳鑒定及測序鑒定。

1.5 survivin-CMV肝癌特異性啟動子的克隆

以含survivin-CMV肝癌特異性啟動子的pBluescriptII-survivin-CMV為模板，設計上游含apaI和下游含NheI的酶切位點的引物。

1.6 穿梭質粒survivin-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的構建

survivin-CMV啟動子PCR擴增產物以ApaI和 NheI雙酶切，連接至同樣雙酶切的pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R，替換穿梭質粒pPRIME中的CMV啟動子，轉化大腸桿菌DH5α，擴增，提取質粒，用ApaI和NheI雙酶切鑒定，測序，提取質粒名為sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

1.7 病毒的包裝、鑒定和擴增純化

1.7.1 病毒的包裝、鑒定 將質粒（pPRIME、pMD2G、psPAX2）、（sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R、pMD2G-anti-AFP-scFv、psPAX2）分別通過Lipofectamin2000共轉染293T細胞，經過病毒空斑純化，包裝成完整病毒顆粒。提取重組病毒DNA，PCR分析、測序鑒定正確者，即為目的病毒PRIME、AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

1.7.2 病毒的擴增及滴度測定 取96孔板，每孔加293T細胞1×104個，加液量200μL，孵箱培養24h后更換無血清培養液；待測病毒用DMEM完全培養液稀釋10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6等稀釋度。每一濃度設3復孔，每孔每一濃度取病毒溶液200μL，同時設培養液對照；在37℃、5%CO2孵箱中繼續培養36～48h。鏡檢觀察CEP現象，按公式計算出病毒滴度：病毒滴度（pfu/mL）＝每孔細胞數×病毒稀釋倍數×10/加入的病毒溶液量（mL）。

煤成說學代表者有郭則華(1981年)、陳安定等(2004年)認為：瀝青煤是石油烴類的衍生礦物，石油的演化是形成瀝青煤的主要機理。這種瀝青煤實際上就是碳瀝青。其成因為古油藏遭受破壞而形成，即油氣散失過程中，在油氣逸散通道中，由于重質成分不斷殘存、充填，最終完全堵塞了裂縫和孔洞而形成的。

1.8 RT-PCR檢測IGF1R在mRNA水平的變化

將L-02、SMMC7721細胞低密度鋪于6孔板，一天后用MOI=10的PRIME、AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R感染細胞，未處理的細胞作為對照組。48h后Trizol法提取各組細胞的總RNA，逆轉錄反應使用隨機引物OligdTs合成第一鏈（嚴格按照廠家說明書進行），在20μL反應體系中加入2μg總cDNA。IGF1RmRNA檢測引物序列為：上游：5'-GGAGGCTGAATACCGCAAAGTC-3'，下游：5'-AAAGACGAAGTTGGAGGCGCT-3'，擴增產物為 398bp；內參照 β-actin，上游：5'-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'，下游：5'-CAGTGTACAGGTAAGCCCTG-3'。退火溫度均為55℃。在同一條件下，每次PCR以β-actin為內參照，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像，表達豐度以特異基因條帶亮度與內參照的比值表示。

1.9 Western-blot鑒定IGF1R的表達

將L-02、SMMC7721細胞鋪于6孔板，一天后用MOI=10.0的PRIME、AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R感染細胞，未處理的細胞作為對照組。48h后提取核蛋白，取40μg細胞裂解液與上樣緩沖液混合，煮沸10min后上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳條件：60伏，30min；160伏，1.5h。電泳結束后，電轉移法將蛋白從凝膠中轉移到PVDF膜上，甲醇固定PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的封閉液40℃孵育過夜。一抗10mL（1∶1000稀釋）室溫孵育2h，二抗10mL（1∶5000稀釋）室溫孵育2h后，PVDF膜用ECL化學發光試劑盒處理并在暗室顯影。

1.10 競爭性抑制試驗

選擇AFP陽性率的SMMC7721細胞株為觀察對象，在細胞感染慢病毒前6h事先加入抗AFP單抗，然后加入慢病毒共同培養48h，觀察綠色熒光細胞數量的變化。

1.11 CCK-8法檢測細胞生長

參照DOJINDO的Cell Count Kit-8，具體操作如下，分別取對數生長期的各組細胞，以每孔4×104~5×104個細胞接種于96孔板中，每孔體積為200μL；24h后換不含胎牛血清的DMEM培養液，繼續培養24h使細胞靜止；將MOI=10的 PRIME、 AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R感染SMMC7721細胞，感染48h后，吸盡待測孔內培養上清液；在酶聯免疫分析儀上測定各孔光吸收值（OD）繪制生長曲線，觀察各組細胞連續7d的細胞的增殖情況。每孔設3個復孔。

1.12 統計學處理

數據以均數±標準差表示，經SAS6.12統計軟件進行t檢驗分析，P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結果

2.1 anti-AFP-scFv基因片段PCR及電泳結果

以表達anti-AFP-scFv的質粒pMON-scFv為模板，設計兩端含SacⅠ和ClaⅠ的酶切位點的引物。ScFv基因由696bp構成，包含312bp中的VL和339bp的VH和兩者之間有45bp的連接序列，擴增片段696bp（圖1）。與預期結果吻合，測序正確。

圖1 VH、VL和ScFv基因PCR擴增產物凝膠電泳

2.2 穿梭質粒pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R的鑒定

將pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R行XhoⅠ、EcoRⅠ酶切鑒定（圖2），鑒定結果與預期相符。片段大小為96bp左右，但因為片段太小不易觀察到，電泳結果示：pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R與對照組pPRIME酶切相比，未見1100bp左右的帶型，且后面的帶位于同一條線上，結果與預期相符。此時命名慢病毒重組載體為pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

圖2 pPRIME-m iR30-shRNA-IGF1R的雙酶切鑒定

2.3 survivin-CMV嵌合啟動子的鑒定

以含survivin-CMV肝癌特異性啟動子的pBluescriptII-sur vivin-CMV為模板，PCR擴增產物經ApaI和NheI、雙酶切，連接至同樣雙酶切的pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R，轉化大腸桿菌DH5α，挑取重組陽性克隆，經ApaI和NheI雙酶切鑒定（圖3），片段大小為860bp左右，結果與預期相符。測序測序結果表明合成的surn-CMV嵌合啟動子插入正確，此時命名慢病毒重組載體為sur-CMV-pPRIME-miR30-shRNA-IGF1R。

圖3 survivin-CMV嵌合啟動子的雙酶切鑒定

2.4 轉染293T細胞的效應

表達質粒共轉染293T細胞，細胞部分融合，多核復合體出現，隨著病毒增殖，細胞內可見多量病毒顆粒，并逐漸從壁上脫落，出現細胞病理效應。病毒滴度測定結果顯示重組慢病毒表達克隆的滴度為4.58×l09pfu/L。

2.5 RT-PCR結果

RT-PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，398bp可見特異性IGF1R目標條帶（圖4），AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R中IGF1R的表達較對照組明顯減低，經灰度掃描及與內參照比較分析，干擾組IGF1RmRNA的表達量僅為對照組的4%（P＜0.05），而轉染正常胎肝細胞L-02后IGF1R的表達與對照組比較無明顯變化。

圖4 RT-PCR檢測感染慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R后IGFIRmRNA的表達

2.6 Western blot檢測結果

實驗發現慢病毒AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R轉染SMMC7721細胞，48h后細胞內的IGF1R的表達與對照組比較明顯下降，約為對照組的9%（P＜0.05），而轉染正常胎肝細胞L-02后，IGF1R蛋白的表達與對照組比較無明顯變化。見圖5。

2.7 競爭性抑制試驗

選擇AFP陽性率的SMMC7721細胞株為觀察對象，在細胞感染慢病毒前6h事先加入抗AFP單抗，然后加入慢病毒共同培養48h，加單抗為（7.5±0.4）%，未加單抗為（76±1.2）%（P＜0.05），見圖6。

2.8 AFP-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R對SMMC7721細胞增殖的影響

從實驗組和對照組的細胞生長曲線（圖7）可以看出，實驗組細胞的生長明顯慢于對照組（P＜0.05）。

圖5 Western-blot檢測感染AFP-sur-CMV-PRIME-m iR30-shRNA-IGF1R后IGFIR蛋白的表達

圖6 競爭性抑制試驗結果

3 討論

腫瘤的基因治療中，表達基因的靶向性和高效表達是關鍵。survivin的組織分布特征具有明顯的細胞選擇性[1]，在終末分化的成人組織中不表達（除胸腺、生殖腺外），而在絕大多數腫瘤組織，包括淋巴瘤、肝癌、結腸癌、胃癌等呈高表達[2]。研究表明，survivin啟動子較CMV啟動子，可以在腫瘤細胞中特異性表達，具有良好的靶向性，在腫瘤的基因治療中具有良好的前景[3]。Van Houdt等[4]克隆了survivin基因起始密碼子上游第-230～+30位和第-1430～+30位兩個survivin啟動子基因片段，證實兩者在轉錄活性、殺滅腫瘤細胞效果、體內抑瘤效果等方面沒有顯著差異。在實驗構建的載體中，重組入的片段過長會使載體的結構發生變化，可能影響預期功能的完成。而survivin全長的啟動子已達1.5kb左右，若要完成預期作用則啟動子后面的功能基因片段長度則可能受到限制，有時無法滿足實驗的需要。Li等[5]報道survivin基因起始密碼子上游第-268～+1位片段已具備啟動子功能。本實驗構利用高活性的巨細胞病毒早期基因增強子（CMVE）[6]增強啟動子的活性，構成了860bp左右的sur vivin-CMV特異性啟動子，提高survivin啟動子的活性，并成功表達。

圖7 細胞生長曲線

慢病毒載體具有可以長時間表達外源基因，容量大，感染細胞種類多而且高效，可以感染體內、體外分裂細胞與非分裂細胞，滴度高，低免疫原性，安全性高[7，8]等優點，成為肝癌基因治療的理想載體。

AFP是目前肝癌生物治療和診斷中用得較多的靶抗原，抗AFP的ScFv在原發性肝癌的生物治療和診斷中都具有重要的作用[9]。

IGF1R是一種跨膜酪氨酸蛋白激酶，在多種腫瘤細胞中有高水平表達[10-12]。但在正常肝組織表達量極少，表皮生長因子（EGF）受體對細胞的有絲分裂作用及轉化潛能必須通過IGF1R才能發揮，而過表達的IGF1R則不需要EGF受體即可引起細胞轉化。研究還表明IGF1R的數量水平在細胞生存中起著決定性作用，只有達到某一水平，才能將細胞由不進行有絲分裂的模式轉化為有絲分裂模式[13]。RNA干擾技術是重要的生物學研究工具，在基因治療中具有良好的前景[14]。針對IGF1R基因的RNA干擾片段裝入特定質粒中，再轉染入人肝癌細胞株，雖然作用時間有所延長，但維持沉默效應的時間有限[15]，因此本實驗在載體選擇和實驗方法上有新的嘗試，是一種有意義的探索。

本實驗經PCR、測序鑒定證實survivin-CMV肝癌特異性啟動子啟動的AFP-survivin-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R慢病毒載體構建成功，對肝癌SMMC7721細胞和胎肝L-02細胞進行體外研究表明，AFP-sur-CMV-PRIME-miR30-shRNA-IGF1R能夠抑制肝癌SMMC7721細胞的生長，并具有特異性。為腫瘤基因治療提供了理論依據和新的思路。

[1]Marusawa H，Matsuzawa S，Welsh K，et al.HBXIP functions as a co-fac-tor of survivin in apoptosis suppression[J].EMBO J，2003，22（11）：2729-2740.

[2]Ouban A，Muraca P，YeatmanT，et al.Expression and distribution of in-sulin-like growth factor-1 receptor in human carcinomas[J].Hum Pathol，2003，34（8）：803-808.

[3] Konopka K，Spain C，Yen A，et al.Correlation between the levels of survivin and survivin promoter-driven gene expression in cancer and non-cancer cells[J].Cell Mol Biol Lett，2009，14（1）：70-89.

[4]Van Houdt WJ，Haviv YS，Lu B，et al.The human survivin promoter：a novel transcriptional targeting strategy for treatment of glioma[J].J Neurosurg，2006，104（4）：583-592.

[5]Li F，Altieri DC.Transcriptional analysis of human survivin gene expression[J].Biochem J，1999，344（Pt 2）：305-311.

[6]Richards CA，Austin EA，HuberB E.Transcriptional regulatory sequences of carcinoembryonic antigen：identification and use with cytosine deaminase for tumor specific gene therapy[J].Hum Gene Ther，1995，6（7）：881-893.

[7]Bauer G，Dao MA，Case SS，et al.In vivobiosafety model to assess the risk of adverse events from retroviral and lentiviral vectors[J].Mol Ther，2008，16（7）：1308-1315.

[8]Haynes JR，Dokken L，Wiley JA，et al.Influenzapseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge[J].Vaccine，2009，27（4）：530-541.

[9] 黃建生，郭秋明.基因工程抗體[M].廣州：華南理工大學出版社，1997：56-70.

[10]Okada E，Murai Y，Matsui K，et al.Survivin expression in tumor cell nuclei is predictive of a favorable prognosis in gastric cancer patients[J].Cancer Lett，2001，163（1）：109-116.

[11]Wang YH，Wang ZX，Qiu Y，et al.Lentivirus-mediated RNAi knockdown of insulin-like growth factor-1 receptor inhibits growth，reduces invasion，and enhances radiosensitivity in human osteosarcoma cells[J].Mol Cell Biochem，2009，327（1-2）：257-266.

[12]Ma Z，Dong A，Kong M，et al.Silencing of the type 1 insulin-like growth factor receptor increases the sensitivity to apoptosis and inhibits invasion in human lung adenocarcinoma A549 cells[J].Cell Mol Biol Lett，2007，12（4）：556-572.

[13]Bauer G，Dao MA，Case SS，et al.In vivobiosafety model to assess the risk of adverse events from retroviral and lentiviral vectors[J]. Mol Ther，2008，16（7）：1308-1315.

[14]Ren K，Jin H，Bian C，et al.MR-1 modulates proliferation and migration of human hepatoma HepG2 cells through MLC2/FAK/Akt signaling pathway[J].J Biol Chem，2008，283（51）：35598-35605.

[15]牛堅，錢海鑫，黃健，等.RNA干涉胰島素樣生長因子1類受體的研究[J].中華實驗外科雜志，2006，23（7）：872-873.