KAI-1轉移抑制基因在裸鼠腎癌轉移中的意義

杜寧克 潘東亮 晉連超 那彥群

（1.北京市門頭溝區中醫院外科，北京102300；2.北京大學吳階平泌尿外科醫學中心，北京大學首鋼醫院泌尿外科，北京100144）

KAI-1基因是一個具有2.4kb的腫瘤轉移抑制基因，編碼白細胞表面糖蛋白，主要參與調控細胞粘附，通過使腫瘤細胞不易脫離原發灶而抑制轉移。它在人類多種正常組織中表達，特別以前列腺、腎、肝、肺、骨髓和胎盤表達最高，而且研究顯示KAI-1低表達與前列腺癌轉移關系密切[1]。本課題組已通過回顧性分析發現T1-3aN0M0腎癌術后轉移的發生與KAI-1表達缺失顯著相關，提示KAI-1基因缺失可能參與了T1-3aN0M0腎癌術后轉移[2]。本課題組于2010年6月～2011年1月通過動物實驗進一步驗證KAI-1在抑制腎癌轉移方面的作用。

1 資料與方法

1.1 腎癌標本和實驗動物

1例手術所取的新鮮腎癌標本，通過免疫組織化學和多聚酶鏈反應（PCR）方法證實為KAI-1表達陰性。BALB/nu裸鼠80只由中國醫學科學院實驗動物所提供，鼠齡4～5周，體重19～22g，雌雄兼用（飼養和接種在SPF條件下的超凈層流架中）。

1.2 主要試劑

培養基MEM（Gibico公司）、CMF-Hanks BSS、胎牛血清、AMV逆轉錄酶、隨機引物、Taq酶、dNTP、RNA酶抑制劑、逆轉錄緩沖液、PCR緩沖液、質粒和脂質體均購自Promega公司。KAI-1一抗（sc-17752，鼠抗人）購自美國Santa Cruz公司，二抗（PV6002，山羊抗鼠）購自美國PowerVision公司。RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。RPMI-1640和胎牛血清購自北京中山試劑公司。

1.3 免疫組織化學方法（IHC）和多聚酶鏈反應（PCR）驗證腎癌組織KAI-1的表達

1.3.1 IHC采用Powe r Vision二步法檢測KAI-1的表達

將石蠟包埋的組織塊切片，厚度為4μm；微波、0.1%胰酶各修復10min；滴加一抗過夜；滴加二抗15min；DAB顯色；二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡觀察。結果判斷標準：用已知陽性片作陽性對照，用緩沖液代替一抗作陰性對照。以細胞漿、膜出現棕黃色顆粒為KAI-1陽性染色的判斷標準。高倍鏡（×400）下選擇10個有代表性的視野，每個視野計數100個腫瘤細胞，計算陽性細胞百分比。腫瘤細胞相應部位不著色或陽性細胞數＜5%為陰性（0）；5%～50%為弱陽性（1+）；＞50%為強陽性（2+）。

1.3.2 PCR步驟 自Genbank查出KAI-1 cDNA序列，設計引物，擴增片斷自cDNA的第168位堿基至300位，片斷長度為798bp。引物序列如下：正義5'CAAGATCTATGGGCTCAGCCTGTATCAAAGTCACC3'，反義5'CCAAGCTTTCAGTACTTGGGGACCTTGCTGTAGTC3'；設計β-actin內參照引物1對，擴增片斷長度為776bp，引物序列如下：正義5'CTATTGGCAACGAGCGGTTC 3'；反義5'CTTAGGAGTGGGGGTGGCTT3'，以上引物均由美國Santa Cruz公司提供。組織總RNA抽提按RNA抽提試劑盒的說明進行。凝膠電泳鑒定RNA質量，紫外分光光度計測定RNA含量。逆轉錄合成cDNA，PCR擴增與電泳，紫外燈下觀察記錄照相。

1.4 腎癌細胞懸液制備

將所取腎癌組織用PBS洗滌；在培養皿內將腎癌組織用刀切成1～2mm3的小塊，用CMF-Hanks BSS洗滌；將組織小塊轉移到離心試管中，加入CMF-Hanks BSS，晃動10min；吸去CMF-Hanks BSS后，加入0.25%胰酶消化液。封管后置37℃下消化45min；收集細胞懸液，置4℃冰箱內冷卻，在所余組織上再一次加入胰酶，重復上述的消化過程，將收集的細胞懸液與已冷卻的細胞懸液混合，重復此步驟10次；將細胞懸液用不銹鋼網篩過濾，收集濾過液；對濾過液離心，轉速1000r/min，離心10min；棄去上清液，將細胞沉淀用少量培養液重新懸浮；用血細胞計數板計數細胞密度，調整細胞密度為1×106個/mL；待接種。

1.5 脂質體介導KAI-1質粒轉染KAI-1陰性腎癌細胞

將上述KAI-1陰性腎癌細胞傳代培養穩定后，通過脂質體介導KAI-1質粒轉染KAI-1陰性腎癌細胞以及轉染成功后KAI-1陽性細胞培養傳代。調整細胞密度為1×106個/mL；待接種。

1.6 裸鼠皮下成瘤接種實驗

將裸鼠分成兩組，各40只。每只裸鼠右后肢皮下接種0.2mL含106個細胞的懸液。一組接種腎癌KAI-1表達陽性細胞懸液；另一組接種腎癌KAI-1表達陰性細胞懸液。觀察裸鼠接種腫瘤生長情況，1～6周每周測量瘤體長徑（a）和短徑（b），計算腫瘤體積（V），V＝a×b2/2和腫瘤生長率（tumor growth rate，TGR），TGR＝（V（第n+1周）/V（第n周））×100%。接種后6周處死裸鼠，取皮下實體腫瘤和肺臟，并將皮下腫瘤稱重。

1.7 肺部轉移瘤計數

取鼠肺臟，在顯微鏡下（×40）計數肺表面結節數量。

1.8 IHC和PCR檢測原腎癌標本、鼠皮下接種瘤和肺轉移瘤KAI-1表達

以上述方法3中的IHC和PCR步驟檢測每只裸鼠皮下接種瘤和肺轉移瘤及其原腎癌標本的KAI-1表達，比較KAI-1在接種、成瘤和轉移過程中的穩定性。

1.9 統計學處理

應用SPSS11.5統計軟件進行統計分析；計量資料用均數±標準差（±s）的形式表示，采用t檢驗，計數資料用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠皮下成瘤實驗

80只裸鼠接種成瘤均獲成活，近1周末時均在接種部位可觸及皮下腫瘤。所有裸鼠腫瘤增長迅速，以接種后2～3周最為明顯。6周時捫及直徑1～2cm大小的塊狀實性腫物。每周接種瘤平均數據見表1。6周末處死裸鼠，解剖發現裸鼠體內成瘤率均為100%。

表1 裸鼠皮下接種瘤生長速度及體積（±s）

表1 裸鼠皮下接種瘤生長速度及體積（±s）

周a（mm） b（mm） V（mm3） TGR（%）1 1.07±0.32 0.78±0.15 0.34±0.12 -2 2.51±0.79 2.18±0.50 6.04±0.89 1776.4 3 4.61±0.97 4.17±0.62 40.56±8.33 671.5 4 6.44±1.31 5.97±1.14 115.10±9.45 283.8 5 8.35±2.23 7.80±1.92 252.47±23.94 219.3 6 9.45±2.77 9.17±2.34 393.35±45.71 115.8

2.2 肺臟表面結節數量

KAI-1表達陽性組：成瘤腫物1.58～2.53g，平均2.16g。38只裸鼠肺臟表面可見直徑1～2mm灰紅色米粒狀結節，40只裸鼠結節數量0～11個，平均6個。KAI-1表達陰性組：成瘤腫物1.34～2.79g，平均2.32g。39只裸鼠肺臟表面可見直徑1～2mm灰紅色米粒狀結節，40只裸鼠結節數量0～57個，平均31個。經統計學處理，兩組肺臟結節數量比較χ2＝5.01，P＜0.05。

2.3 IHC和PCR對接種瘤、肺轉移瘤和原腎癌標本的檢測

鏡下見皮下接種瘤和肺轉移瘤呈實性結構，瘤細胞分布密集、雜亂，大小不一，核分裂相多見，胞漿呈透明狀。經IHC（圖1）和PCR（圖2）檢測，每只裸鼠接種瘤和肺轉移瘤的KAI-1表達均與原腎癌標本一致。

圖1 KAI-1表達陽性腎細胞癌肺轉移瘤KAI-1免疫組織化學染色（2+）（×200）

圖2 RT-PCR檢測腎癌中KAI-1基因陽性表達：表現為約800bp處特異核酸片斷條帶

3 討論

盡管有關腎癌轉移研究成果的報道不斷增多，但其轉移機理仍未明確。例如，VHL腫瘤抑制基因的失活可導致腫瘤血管內皮生長因子過度生成，促進腫瘤血管形成和腎癌的轉移[3]；VHL基因的丟失通過低氧誘導因子途經轉導CUB域包含蛋白1信號給PKCδ，激活并增加腎癌細胞的轉移[4]。其他研究顯示，CD151高表達與腎透明細胞癌的高期高核級別相關[5]；Forkhead轉錄因子1與腎癌細胞級別和Ki67表達相關[6]；Glutathione S轉化酶是一種高度特異性的預測腎癌進展和預后的標記物[7]。VHL腫瘤抑制基因、MET原癌基因、TFE3轉錄因子癌蛋白等多種因素及途徑共同參與了腎癌的進展[8]。男性腎癌具有更高的臨床分期和診斷時更高的轉移發生率、更低的腫瘤特異性存活率，但是性別仍不是獨立的預后指標[9]。這進一步豐富了腎癌轉移機理，但是仍不能為臨床工作提供直接、確切、實用的標記物。

KAI-1氨基酸序列的保守性可使鼠實驗結果對人類具有高度提示意義。KAI-1基因翻譯出的蛋白質與已發現的CD82結構相同，是TM4SF（transmembrane 4 superfamily）或TST（tetra spans transmembrane）家族成員。CD82的氨基酸序列在人、猴、狗、兔、牛與大、小鼠中相當保守[10]。因此，在裸鼠體內研究所得KAI-1轉移抑制基因表達與腎癌轉移關系的結果對人類也具有重要的提示意義。本研究選用的兩種腎癌細胞株具有同一來源，基因組中僅有KAI-1全或無的差別；而且在實驗中反復通過免疫組織化學和PCR方法進行測試排除了KAI-1發生突變的可能性，所以保證了實驗結果的科學性和可靠性。

KAI-1表達缺失組裸鼠肺臟表面轉移灶數量增多。本實驗中KAI-1表達陽性組裸鼠肺臟表面的轉移瘤數量為0～11個，平均6個；KAI-1表達陰性組轉移瘤數量為0～57個，平均31個；兩者數量比較具有統計學意義，證實了KAI-1表達缺失促進了腎癌細胞的轉移，為臨床檢測KAI-1表達預測腎癌轉移提供了可靠的實驗依據。另外本實驗發現，在裸鼠皮下的成瘤實驗6周內中出現了肺臟轉移瘤，提示腎癌轉移發生的時間可能較早，只是最早發生轉移的時間以及與原發瘤大小的關系尚缺乏研究。本實驗還顯示，即使KAI-1表達陽性組腎癌也有轉移瘤，只是與KAI-1表達陰性組相比數量較少，說明KAI-1基因不是決定腎癌轉移的唯一因素。

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