動(dòng)態(tài)濁度法測定注射用高純度尿促性素中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量*

劉 肅 周永標(biāo) 肖 瑛 潘衛(wèi)松

（1.廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東廣州510610；2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510632；3.暨南大學(xué)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及創(chuàng)新藥物研究所廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632）

注射用高純度尿促性素（highly purified menotrophin for injection）是從天然提取的促性腺激素制劑，其中含有卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH），可獨(dú)立地作為促排卵治療的用藥，也應(yīng)用于低促性腺激素性性腺功能不全的男性和女性，還廣泛應(yīng)用于行體外受精的控制性促排卵的婦女中[1]。筆者依照2005年版《中國藥典》收載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，對其細(xì)菌內(nèi)毒素的定量和定性檢查進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器

細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀（天津大學(xué)無線電廠，BET-32B）；SUB14恒溫水浴（英國GRANT公司）；MSI旋渦混合器（廣州IKA公司）。

1.2 試驗(yàn)藥品

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（規(guī)格：120EU/支，批號：150601-200966）購自中國藥品生物制品檢定所；內(nèi)毒素檢查用水（規(guī)格：50mL/支，批號：1002050）及鱟試劑（TAL）均購于湛江安度斯生物有限公司（動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑，規(guī)格：1.25mL/支，批號：0802020，靈敏度：10～0.1EU/mL；凝膠法鱟試劑，規(guī)格：0.1mL/支，批號：0903311，靈敏度：0.125EU/mL）；注射用高純度尿促性素由輝凌（德國）制藥有限公司提供（批號：CE0078A）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定[2-4]

根據(jù)公式：細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）=K/M。式中，M為人用每公斤體重每小時(shí)最大劑量。依據(jù)藥品使用說明書，初始劑量為每日1～2支，之后可以逐漸增加劑量，故成人每日最大給藥量以10支計(jì)算，中國人均體重按60kg計(jì)，則M=10支/（kg·h），K為人用每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量。K值取5EU/（kg·h），則L=5EU/（kg·h）×60kg/10支·h-1=30EU/支。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水對細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，使其細(xì)菌內(nèi)毒素最終濃度分別為10.0，1.0，0.1，0.01EU/mL。各取0.1mL分別加到預(yù)先加有0.1mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，在旋渦混合器上輕輕混合均勻，插入BET-32B細(xì)菌內(nèi)度素檢測儀內(nèi)進(jìn)行檢測，其中每一個(gè)濃度做2支平行管，并同時(shí)做陰性對照2管（NC），陽性對照2管（PPC）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按最小二乘法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為：lgT=2.79178+（-0.24828lgC），r=-0.9932，反應(yīng)時(shí)間在371～2093s。陰性對照管反應(yīng)時(shí)間＞3600s。結(jié)果可見，陰性對照管反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間，|r|＞0.980，故標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性成立。

表1 注射用高純度尿促性素干擾試驗(yàn)

2.3 干擾試驗(yàn)

將注射用高純度尿促性素以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成10倍、20倍、40倍、80倍4個(gè)濃度系列。每個(gè)濃度分別取0.1mL加入0.1mL鱟試劑溶液作為供試品檢查管。同時(shí)，取這4個(gè)稀釋濃度的樣品溶液0.5mL，加入0.5mL細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1.0EU·mL-1），混勻，作為供試品干擾試驗(yàn)中供試品陽性對照溶液。每個(gè)濃度溶液分別取0.1mL，加到預(yù)先加有0.1mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混勻，作為供試品陽性對照管。立即插入BET-32B型細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀進(jìn)行檢測，其中每一濃度重復(fù)2管，計(jì)算平均回收率，回收率（%）=（Cs-Ct）/λm×100%（見表1）。由表可見回收率均在50%～200%，可知，注射用高純度尿促性素在此稀釋倍數(shù)下，對細(xì)菌內(nèi)毒素檢測無干擾作用。

2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測

根據(jù)《中國藥典》2005年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素定量測定法進(jìn)行定量測定，同時(shí)按照《中國藥典》2005年版附錄凝膠法進(jìn)行定性檢查，動(dòng)態(tài)濁度法實(shí)測內(nèi)毒素13.824EU/支，回收率112%；凝膠法陰性。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測的凝膠法與動(dòng)態(tài)濁度法都是藥典所規(guī)定的方法，凝膠法不需要專門的儀器，且定性檢查進(jìn)行限度控制成本低廉，操作更加簡便易行，動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行定量檢查，需要專門設(shè)備，試劑成本相對昂貴，但是靈敏度高[5-9]。本品注射用高純度尿促性素使用動(dòng)態(tài)濁度法與凝膠法檢測結(jié)果一致，提示用兩種方法進(jìn)行本品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查都是可行的。

[1]陳新娜，喬杰，何方方，等.高純度尿促性素和普通尿促性素促排卵效果[J].中國生育健康雜志，2005，16（4）：205-208.

[2]關(guān)倩明，歐潔赟.頭孢尼西鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2006，7（4）：26-27.

[3]巴力吉尼瑪，韓斯琴.三磷酸腺苷二鈉注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的定量檢查[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28（16）：1420-1421.

[4]潘衛(wèi)松，肖瑛，潘建明.熒光素鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國藥房，2009，20（13）：1010-1012.

[5]潘衛(wèi)松，肖瑛.透明質(zhì)酸鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，20（6）：45-47.

[6]周永標(biāo)，潘衛(wèi)松.從葛根素的異常毒性實(shí)驗(yàn)看藥用輔料的重要性[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（13）：47-48.

[7]楊晨曦.細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)?zāi)z定性法與動(dòng)態(tài)濁度定量法的比較[J].臨床血液學(xué)雜志，2010，23（6）：366-382.

[8]潘衛(wèi)松，肖瑛，李薇.皮膚組織中SOD活性測定的樣品制備方法[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（32）：27-28.

[9]潘衛(wèi)松，劉美鳳，石鉞，等.血清藥理學(xué)、血清化學(xué)和中藥藥代動(dòng)力學(xué)[J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化，2002，4（3）：53-56.