QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法同時測定土壤中5種常用除草劑

摘 要 建立了超高效液相色譜串聯質譜法（UPLC-MS/MS）簡單、快速、靈敏、準確地同時測定土壤中5種常用除草劑多殘留量的方法。樣品經改進的QuEChERS（快速、簡單、廉價、高效、靈活和安全）方法一步完成萃取凈化，未使用緩沖鹽溶液，經乙腈萃取，N-丙基乙二胺（PSA）和C18吸附劑填料凈化，離心后直接過膜上機檢測，萃取和凈化的效果滿足檢測要求。UPLC-MS/MS 方法采用Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（50 mm×2.1 mm i.d.， 1.7 色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為甲醇和水，梯度洗脫，流速0.25 mL/min，電噴霧電離源正離子（ESI＋）多反應監測（MRM）模式檢測，外標法定量。5種常用除草劑在0.5～200

關鍵詞 超高效液相色譜串聯質譜法; 除草劑; 多種殘留； 土壤; QuEChERS方法

1 引 言

除草劑是土壤中環境激素類物質的主要來源之一。目前，被廣泛使用的除草劑，如莠去津、異丙甲草胺、環嗪酮，它們的化學性質穩定，既具有較強的親脂性，能持久存在于土壤環境中，破壞土壤結構，阻礙或抑制土壤微生物和植物的生命活動；也具有較強的水溶性，可以通過滲透和降水的淋洗作用污染地表水體系。另外，除草劑還可以通過食物鏈累積放大，致使生物體天然激素分泌失調，導致病變，危害人類健康。因此，除草劑對環境和人類健康造成的危害備受關注。

目前，除草劑在土壤中的殘留檢測方法包括氣相色譜法[1，2]、高效液相色譜法[3]及氣相色譜-質譜聯用法[4～6]及液相色譜-質譜聯用方法[7～11]。本研究將超高效液相色譜-質譜聯用法 （UPLC-MS/MS）應用于除草劑多殘留痕量快速分析（3 min內完成一個樣品多殘留檢測，比傳統方法快5～10倍）；具有靈敏度高、確證性強（多反應監測模式，即MRM方式）、抗干擾能力強（通過單通道掃描檢測，對前處理要求較低）等優勢。

近幾年， 農藥殘留分析的樣品前處理趨于簡單化和環境友好，目前應用較廣的土壤前處理方法有固相萃取（SPE）[11，12]，加速溶劑萃取（ASE）[13]，微波輔助萃取（MAE）[14]和超聲波輔助萃取（USE）[8]。這些方法取代了傳統的耗費大量時間和溶劑的索式萃取法，但是需要較昂貴的萃取儀器，且通常需要后續的較繁瑣的凈化步驟，有的萃取過程還需要在高溫下進行。QuEChERS方法[15，16]是一種快速、簡單、廉價、高效、耐用、安全的樣品前處理方法，在食品安全領域得到了廣泛應用[17]，而在土壤中的應用少見報道。

本研究將改進的QuEChERS方法應用于土壤樣品前處理。為了防止緩沖鹽對質譜測定的干擾，樣品前處理過程未使用緩沖溶液，考察了不同吸附劑的凈化效果，同時簡化了前處理步驟，萃取后直接在萃取懸浮液中加入吸附劑， 一步完成土壤樣品的萃取和凈化，無需多步離心，且提取液無需濃縮，直接進行UPLC-MS/MS分析，在3 min內即可完成土壤中莠去津、苯噻酰草胺、甜菜寧、異丙甲草胺和環嗪酮5種除草劑的殘留量定性與定量檢測。方法簡便、快速、準確、靈敏，能滿足土壤中殘留限量要求及農殘檢測確證要求。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

ACQUITYTM 超高效液相色譜儀（Waters公司）；Micromass-Quattro Premier XE三重四極桿質譜儀，配有ESI電離源（Waters公司）；Micromass Quattro premier、MassLynx數據處理系統（美國Waters公司）；離心機（AllegraTM X-22R型，Beckman公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；0.22

移液器（法國Gilson公司）；甲醇、乙腈（HPLC級，美國Fisher公司）；甲酸（HPLC級，美國Tedia公司）。農殘級無水MgSO4及吸附劑填料N-丙基乙二胺（PSA），石墨化碳黑（GCB），C18均購自天津Agela公司。

莠去津、苯噻酰草胺、甜菜寧、異丙甲草胺和環嗪酮5種除草劑標準品（純度＞98%， 北京化工大學標準物質研究所）。用甲醇將標準品配制成濃度為1000 mg/L的單標標準儲備液，再將單標標準儲備液用稀釋配制成混標儲備液（甜菜寧為2 mg/L，其它4種除草劑均為0.5 mg/L），實驗時以初始流動相將混合標準儲備液配制成不同濃度的標準工作液。

2.2 前處理方法

2.2.1 土壤樣品的制備 土壤樣品經自然風干，過1 mm篩后，室溫下保存備用。樣品檢測結果顯示未殘留待測除草劑，可以作為空白土壤樣品。準確稱取1 g過篩土壤樣品，加入到15 mL離心試管中，加入適量混合標準溶液以達到所需的添加水平。加標后，甲醇溶液液面微高于土壤樣品，使除草劑在土壤中徹底混勻。萃取前，將加標土壤樣品敞口置于通風櫥中24 h， 以揮干溶劑和老化樣品。

2.2.2 QuEChERS一步萃取凈化方法 準確稱取1.0 g加標土壤樣品，置于15 mL塑料離心管中，加入0.5 mL水浸潤20 min，加入4 mL乙腈，渦旋萃取2 min，加入0.1 g無水MgSO4，渦旋20 s，加入0.1 g PSA（或0.1 g PSA＋0.1 g C18，或0.1 g PSA＋0.03 g GCB）吸附劑，渦旋2 min，以10000 r/min高速離心3 min，取上清液直接過膜上機檢測。

2.3 分析條件

2.3.1 超高效液相色譜條件 Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm i.d.， 1.7

3 結果與討論

3.1 色譜條件的選擇

分別采用甲醇-水和乙腈-水為流動相，在甲醇-水流動相中，5種除草劑的靈敏度均高于乙腈-水流動相，這主要是因為在ESI電離源-液質聯用技術中，目標物在甲醇中的離子化效率高，分析靈敏度較高。本實驗采用甲醇-水流動相，優化的最佳色譜條件見2.3.1節，在3 min內完成了5種除草劑的分離檢測，分離度好，峰形尖銳（圖1），各物質的保留時間見表1。

3.2 質譜條件的選擇

在ESI＋模式下，對5種除草劑農藥的質譜條件進行了優化，分別采用全掃描和子離子掃描方式優化得到了母離子、子離子及各自的最佳萃取錐孔電壓和碰撞能量，以響應值最大的碎片離子（子離子）為定量離子，次級響應離子為定性離子，從而得到了最優質譜條件（表1）。圖1A為MRM模式下5種除草劑的定量離子對的單通道掃描質譜圖，各物質的峰形尖銳，靈敏度高，確證性強。

3.3 改進的QuEChERS一步萃取凈化樣品前處理方法

3.3.1 QuEChERS前處理步驟的簡化 QuEChERS方法多應用于蔬菜、水果和肉類等食品中，多采用緩沖溶液調節樣品的pH值，以保持目標化合物的穩定和萃取效率。由于食品樣品本身含有大量水分，緩沖鹽的存在顯著降低了目標物在液質聯用測定時的離子化效率，所以在前處理過程中必須進行除鹽。土壤樣品含水量少，pH多為中性，且相對穩定，因此本研究采用無緩沖溶液的QuEChERS方法，可以省去除鹽步驟，適合直接進行液質聯用分析。

本研究還對萃取凈化的前處理步驟進行了簡化，分別考察了土壤樣品前處理方法1和經改進簡化了操作步驟的方法2。在方法1中，土壤樣品經乙腈萃取，并加入無水MgSO4吸水后，需將萃取液高速離心，取出上清液； 向上清液中加入無水MgSO4和吸附劑進行凈化，然后再次高速離心，取上清液檢測。改進的QuEChERS方法2是將土壤樣品萃取后直接在萃取懸浮液中，加入無水MgSO4和吸附劑進行凈化，萃取和凈化一步完成，且步驟中只需經一次高速離心即可取上清液檢測。實驗表明，方法1和方法2的5種除草劑的回收率均較好，無明顯區別（圖2），因此這兩種方法均可以采用，為使實驗操作更簡單、快速，在后續實驗中采用改進的一步萃取凈化的QuEChERS方法2。

3.3.2 吸附劑的選擇 吸附劑對回收率的影響既因為吸附劑對分析物的吸附作用，又由于吸附劑對雜質的吸附凈化效果可能導致的基質效應，影響分析物在ESI電離源質譜中的響應值。吸附劑的選擇取決于樣品萃取物中的脂肪或者色素等雜質的含量：（1）如果樣品中脂肪含量大于5%，吸附劑中需包含PSA和C18；（2）如果脂肪含量小于5%，而且萃取物中只含有少量色素或不含色素，吸附劑選用PSA即可；（3）如果脂肪含量小于5%，而且萃取物中含有大量色素，吸附劑中需包含PSA和GCB。土壤樣品中存在色素、脂肪、甾醇等雜質，為選擇合適的吸附劑，比較了3種不同的吸附劑凈化的樣品回收率。

在進行了萃取步驟后（2.2.2節），分別加入不同的吸附劑： 0.1 g PSA（或0.1 g PSA＋0.1 g C18，或0.1 g PSA＋0.03 g GCB）進行凈化，回收結果見圖3。由圖3可見，PSA＋C18吸附劑的回收率最高，說明該吸附劑對分析物吸附作用較小，同時對色素、脂肪、甾醇等雜質的凈化效果較好，因此選擇PSA＋C18作為吸附劑。圖1B由上至下依次為5種除草劑的標準品質譜圖；經0.1 g PSA＋0.1 g C18吸附劑填料按2.2.2節方法處理的加標樣品和空白土壤樣品質譜圖，可以看到空白土壤背景值干凈，加標樣品的分離度和峰形均較好，可以進行定性定量檢測，圖1A為定量離子對的MRM質譜圖。

References

1 HE Min， JIA Chun-Hong， YU Ping-Zhong， CHEN Li， ZHU Xiao-Dan， ZHAO Er-Cheng （賀 敏， 賈春虹， 余平中， 陳 莉， 朱曉丹， 趙爾成）. Agrochemicals（農藥）， 2009， 48（12）: 902～903

2 Pinto C G， Laespada M E F， Martín S H， Ferreira A M C， Pavón J L P， Cordero B M. Talanta， 2010， 81（1-2）: 385～391

3 ZHANG Liang， SUN Jian-Ning， XIONG Xian-Gui， JIA Hui-Xian （張 亮， 孫劍寧， 熊先貴， 賈慧嫻）. Chinese Journal of Analysis Laboratory （分析試驗室）， 2010， 29（12）: 84～86

4 Lesueur C， Gartner M， Mentler A， Fuerhacker M. Talanta， 2008， 75（1）: 284～293



5 GUI Jian-Ye， ZHANG Li， LIU Ji-Hua， ZHANG Yong-Tao， ZHUO Hai-Ying， LI Xiao-Ya， ZHANG Lin， LI Gui-Xiang（桂建業， 張 莉， 劉繼華， 張永濤， 左海英， 李小亞， 張 琳， 李桂香）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2010， 389（8）: 1177～1181

6 Rashid A， Nawaz S， Barker H， Ahmad I， Ashraf M. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（17）: 2933～2939

7 Maía Ibez， scar J. Pozo， Juan V. Sancho， Francisco J. López， Hernndez F. J. Chromatogr. A， 2005， 1081（11）: 145～155

8 NIN Zeng-Yuan， LUO Xin， TANG Zhi-Xu， YE Xi-Wen， SUN Yin-Feng， ZHANG Hong-Wei， WANG Feng-Mei （牛增元， 羅 忻， 湯志旭， 葉曦雯， 孫銀峰， 張鴻偉， 王鳳美）. Chinese J. Anal. Chem. （分析化學）， 2009， 37（4）: 505～510

9 HU Kai-Feng， SUN Tao， LIU Sheng-Hong， QIAO Kun-Yun （胡開峰， 孫 濤， 劉圣紅， 喬坤云）. Journal of Instrumental Analysis （分析測試學報）， 2010， 29（11）: 1216～1220

10 LIU Jin-Xia， ZHANG Ying， DING Li， LIU Xiao-Xia， HUANG Zhi-Qiang， CHEN Bo， WANG Li-Bing（劉錦霞， 張 瑩， 丁 利， 劉曉霞， 黃志強， 陳 波， 王利兵）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2011， 39（5）: 664～669

11 YE Gui-Biao， ZHANG Wei， CUI Xin， PAN Can-Ping， JIANG Shu-Ren（葉貴標， 張 微， 崔 昕， 潘燦平， 江樹人）. Chinese J. Anal. Chem.（分析化學）， 2006， 34（9）: 1207～1212

12 Ozcan S， Tor A， Aydin M E. Anal. Chim. Acta， 2009， 640（1）: 52～57

13 Dagnac T， Bristeau S， Jeannot R， Mouvet C， Baran N. J. Chromatogr. A， 2005， 1067（1）: 225～233

14 Papadakis E N， Vryzas Z， Papadopoulou-Mourkidou E. J. Chromatogr. A， 2006， 1127（2）: 6～11

15 Foods of Plant Origin， Determination of Pesticide Residues Using GC–MS and/or LC-MS/MS Following Acetonitrile Extraction/Partitioning and Clean-up by Dispersive SPE， QuEChERS-Method， CEN Standard Method EN 15662， European Committee for Standardization Standard Method.

16 Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulphate-Gas Chromatography/Mass Spectrometry and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry， AOAC Official Method 2007.01， 18th ed.， Official Methods of Analysis of AOAC International， 2007

17 GONG Xiao-Ming， DONG Jing， SUN Jun， YU Jin-Ling， PAN Shou-Qi， WANG Hong-Tao， DING Kui-Ying （宮小明， 董 靜， 孫 軍， 于金玲， 潘守奇， 王洪濤， 丁葵英）. Journal of Instrumental Analysis （分析測試學報）， 2010， 29（9）: 933～937

QuEChERS-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass

Spectrometry for Determination of 5 Currently Used Herbicides

MEI Mei， DU Zhen-Xia*， CHEN Yun

（College of Science， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 100029）



Abstract A simple， rapid sensitive and accurate ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for the simultaneous determination of five currently used herbicides in soil. The sample preparation using the modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged， and safe） method completed the extraction and clean-up steps in one procedure. In this none buffer QuEChERS method， samples were extracted with acetonitrile， cleaned up with primary secondary amine （PSA） and C18 sorbent， then centrifugated and filtrated before detection. The pretreatment method was simple， rapid and effective and can meet the detection requirements. The UPLC-MS/MS method was performed on Waters ACQUITY UPLCTM BEH Ｃ18 （50 mm×2.1 mm i.d.， 1.7

SymbolmA@ m） and the column temperature was 30 ℃， the gradient elution with methanol and pure water as the mobile phase and the flow rate was 0.25 mL/min. The positive electrospray ionization （ESI＋） source under the multiple reaction monitoring （MRM） mode and external standard method were used for quantification. The results showed that the correlation coefficients up to 0.9984 were obtained across a concentration range of 0.5－200