毛細(xì)管區(qū)帶電泳測(cè)定D1蛋白酶的活性及其抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選

摘 要 建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)快速測(cè)定D1蛋白酶活性及其抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選方法。實(shí)驗(yàn)選用未涂層熔融石英毛細(xì)管（43 cm 和磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L， pH 3.0）作為分離介質(zhì)，運(yùn)行電壓18 kV，測(cè)定了D1蛋白酶的活性并對(duì)部分抑制劑先導(dǎo)化合物進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明， ITP26和ITP21兩種異GFDA1唑噻唑哌啶類(lèi)先導(dǎo)化合物對(duì)蛋白酶活性具有抑制作用，抑制率分別為26%和13%。

關(guān)鍵詞 D1蛋白酶； 毛細(xì)管區(qū)帶電泳； 活性； 先導(dǎo)化合物

1 引 言

D1蛋白酶（D1 C-terminal processing protease， CtpA）是由葉綠體核ctpA基因編碼、含有389個(gè)氨基酸殘基的單亞基蛋白，分子量約為45 kDa，廣泛存在于各種生物體中[1]。其作用主要是通過(guò)剪切D1蛋白前體C端延伸的肽段，促使其轉(zhuǎn)化成具有活性的D1蛋白，用于光合系統(tǒng)II中錳簇復(fù)合物的組裝，是植物進(jìn)行光合作用所必須的步驟，因此D1蛋白酶被認(rèn)為是一種新型優(yōu)異的廣譜除草劑作用靶標(biāo)[2]。

開(kāi)發(fā)以D1蛋白酶為靶標(biāo)的新型農(nóng)藥，首先需要獲得具有生物活性的重組蛋白酶和選擇合適的先導(dǎo)化合物抑制活性篩選方法。D1蛋白酶活性檢測(cè)通常采用兩種方法：一是采用前體蛋白作為反應(yīng)底物，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 遷移檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物[3]；二是以合成的D1 前體蛋白剪切位點(diǎn)附近的肽段作為反應(yīng)底物，剪切后的肽段采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分離和檢測(cè)[4]。前者凝膠遷移法準(zhǔn)確度較低，不適合大規(guī)模操作；后者的準(zhǔn)確度較高，但由于采用高效液相色譜法，分析過(guò)程耗時(shí)較多，也不適合快速和高通量篩選的要求。毛細(xì)管電泳（CE）具有靈敏度高、環(huán)境污染少、進(jìn)樣量小、樣品不需前處理、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在生物工程、藥物分析和檢測(cè)等領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用，可用于多肽分離和蛋白質(zhì)的分析[5～7]。本研究采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳建立了重組D1蛋白酶生物活性的測(cè)定方法，并用于抑制劑先導(dǎo)化合物篩選。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑P/ACE MDQ 型毛細(xì)管電泳儀（美國(guó)Beckman-Coulter公司）；熔融石英毛細(xì)管柱（河北永年銳灃色譜器件公司，50 cm 有效長(zhǎng)度43 cm）；KTA purifier 100 蛋白純化系統(tǒng)（GE Healthcare， 美國(guó)）。9肽（9P， AIEAPSTNG）、24肽（24P， VMHE RNAHNFPLDLAAIEAPSTNG）均由上海吉爾生化公司合成；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1重組蛋白酶的表達(dá)和純化 D1蛋白酶的表達(dá)和純化參照文獻(xiàn) [8]的方法，將純化得到的蛋白溶液超濾濃縮，采用HiTrap脫鹽柱除去咪唑，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定和分析。

2.2.2 毛細(xì)管電泳分離條件的選擇 毛細(xì)管電泳分離選用磷酸鹽緩沖液，以未涂層的石英毛細(xì)管為分離柱（有效長(zhǎng)度43 cm，內(nèi)徑75 上清液進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，以多肽峰面積確定酶活性大小。進(jìn)行抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選時(shí)，酶溶液和待測(cè)化合物（DMSO溶解）混合后首先在25 ℃恒溫水浴中放置30 min，使二者充分結(jié)合，然后進(jìn)行酶活性的測(cè)定。分別以緩沖液和DMSO代替化合物溶液作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)24肽吸收峰面積的變化計(jì)算抑制率。

3 結(jié)果與分析

3.1 D1蛋白酶的表達(dá)和純化

為了獲得具有較高生物活性的重組D1蛋白酶，對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)選擇降低誘導(dǎo)劑的使用濃度和誘導(dǎo)溫度，獲得了可溶性表達(dá)的重組蛋白酶。采用親和層析法純化得到的蛋白酶純度可達(dá)到95%以上（圖1），比活力為1.10

為文獻(xiàn)[9]的15倍，可用于毛細(xì)管電泳分析。

3.2 電泳分離條件的優(yōu)化

3.2.1 緩沖液pH值對(duì)分離的影響 運(yùn)行緩沖液pH值在2～10范圍內(nèi)對(duì)多肽保留時(shí)間影響的結(jié)果如圖2所示。在pH值6～8范圍內(nèi)，兩種多肽達(dá)不到完全分離的要求。將pH值提高至9～10時(shí)，化合物的保留時(shí)間有所差別，但差別較小。而將pH值降低至2～5后，兩種小肽的分離度增大。其原因是高pH值條件下， 毛細(xì)管柱內(nèi)壁表面的硅羥基發(fā)生電離， 其表面負(fù)電荷密度增加， 導(dǎo)致電滲流增大，縮短了待測(cè)物的出峰時(shí)間。隨著pH值的降低， 硅羥基的電離受到抑制， 電滲流也相應(yīng)降低。當(dāng)pH＜3后， 質(zhì)子化作用使得電滲流趨于零， 此時(shí)pH值的改變對(duì)電滲流的影響較小[10]。本實(shí)驗(yàn)確定最適pH值為3。

3.2.2 緩沖液濃度對(duì)分離的影響 緩沖液濃度為20和30 mmol/L時(shí)，兩種多肽的遷移時(shí)間較短，分離度較低，峰形較寬（見(jiàn)圖3）。濃度增大至50 mmol/L時(shí)，多肽的遷移時(shí)間增大，但譜峰變得較為尖銳，分離度也相應(yīng)提高。其原因在于增大緩沖液濃度后， 溶液的離子強(qiáng)度增加，毛細(xì)管內(nèi)壁的雙電層壓縮，減小了電滲流， 待測(cè)物的遷移速度降低， 遷移時(shí)間增加。 增大緩沖液的濃度可以減弱樣品之間以及樣品與毛細(xì)管壁間的相互作用， 從而減少譜帶變寬， 提高分離效率[11]。但當(dāng)濃度進(jìn)一步增大到高于50 mmol/L時(shí)，會(huì)導(dǎo)致焦耳熱升高，反而使得譜帶變寬，并產(chǎn)生一些雜峰。本實(shí)驗(yàn)中緩沖液濃度選擇為50 mmol/L。[TS（] 圖3 運(yùn)行緩沖液濃度對(duì)多肽分離度的影響

3.2.3 分離電壓和進(jìn)樣時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著分離電壓的升高，電滲流增大，樣品遷移時(shí)間縮短。運(yùn)行電壓繼續(xù)增大后，過(guò)量的焦耳熱不能有效散發(fā)，從而形成徑向溫度梯度[12]，使得基線噪音增大，出現(xiàn)過(guò)多的干擾峰，導(dǎo)致分離度降低。但采用較小的分離電壓，不僅使得分離時(shí)間延長(zhǎng)，也會(huì)降低分離度。因此確定的最佳分離電壓為18 kV。此外，如果進(jìn)樣時(shí)間較短，樣品的峰面積較小，重現(xiàn)性也較差，會(huì)產(chǎn)生較大的分析誤差；延長(zhǎng)進(jìn)樣時(shí)間，雖然可以增加檢測(cè)的靈敏度，但由于樣品超載，造成進(jìn)樣區(qū)帶擴(kuò)展，從而導(dǎo)致樣品峰出現(xiàn)變寬、拖尾等現(xiàn)象。最終確定最佳進(jìn)樣時(shí)間為10 s。

3.3 D1蛋白酶活性的測(cè)定及其抑制劑先導(dǎo)化合物的篩選

以合成的D1前體蛋白羧基端延伸的24肽作為模擬底物，采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定了D1蛋白酶的生物活性，所得結(jié)果如圖4所示。蛋白酶水解24肽后生成相應(yīng)的9肽和15肽，反應(yīng)后24肽對(duì)應(yīng)的吸收峰高明顯降低，同時(shí)在17.7 min處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，經(jīng)過(guò)對(duì)照確認(rèn)為9肽。此外，在16 min位置還出現(xiàn)了一個(gè)小的吸收峰，推測(cè)可能為生成的15肽。根據(jù)24肽反應(yīng)前后吸收峰面積的變化可知其被水解了43%，與高效液相色譜法測(cè)定的活性較為接近。

從圖4可見(jiàn)，在反應(yīng)體系中加入蛋白酶后，24肽和9肽的遷移時(shí)間以及兩者的間隔明顯增大，吸收峰也變寬。其原因在于加入高濃度的蛋白質(zhì)分子后，蛋白質(zhì)與毛細(xì)管壁產(chǎn)生吸附效應(yīng)，使電泳區(qū)帶增寬，導(dǎo)致吸收峰的拖尾和變形。此外，高濃度蛋白質(zhì)的加入還改變了緩沖液的粘度以及與毛細(xì)管壁發(fā)生了作用[13]，影響了電滲流，從而導(dǎo)致24肽與9肽的遷移時(shí)間增大和吸收峰變寬。

抑制劑先導(dǎo)化合物對(duì)D1蛋白酶抑制活性的測(cè)定結(jié)果如圖5所示。由于先導(dǎo)化合物的溶解性較差，僅溶于二甲亞砜（DMSO），考察了DMSO對(duì)D1蛋白酶活性的影響。從圖5可見(jiàn)，少量 DMSO的加入對(duì)蛋白酶的活性影響很小，因此可以忽略溶劑對(duì)酶活性測(cè)定的影響。當(dāng)?shù)鞍酌概c先導(dǎo)化合物ITP21作用后，發(fā)現(xiàn)其具有較明顯的抑制作用，24肽對(duì)應(yīng)的吸收峰較未加入化合物體系的24肽吸收增高，而9肽和15肽對(duì)應(yīng)的吸收峰消失，證實(shí)了毛細(xì)管電泳法對(duì)先導(dǎo)化合物抑制活性進(jìn)行測(cè)定的可行性。

分別測(cè)定了19個(gè)先導(dǎo)化合物對(duì)D1蛋白酶的抑制活性，結(jié)果表明，兩種異噁唑噻唑哌啶類(lèi)先導(dǎo)化合物ITP21和ITP26對(duì)D1蛋白酶具有一定程度的抑制作用，其抑制率分別為21%和13%，其它先導(dǎo)化合物對(duì)蛋白酶的抑制活性不明顯。本方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，可用于D1蛋白酶抑制劑先導(dǎo)化合物篩選。

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Determination of D1 Protease Activity and Screening for Lead Compounds of Inhibitor by Capillary Zone Electrophoresis

CHEN La-Yue1， LI Wei-Guo*2， HUANG Xue-Ying2， LIU Zhong-Lai1， LIU Yan-Li1，

FENG Lu2， LIAO Hong-Shan2， XIONG Guo-Mei1， QI Chao*1

1（Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation Integrative Biology， College of Life Science，

Central China Normal University， Wuhan 430079）

2（Key Laboratory of Pesticide Chemical Biology， Ministry of Education， College of Chemistry，

Central China Normal University， Wuhan 430079）

Abstract Capillary zone electrophoresis （CZE） with UV detection has been used for the determination of D1 protease activity and screening for lead compounds of inhibitor. Separation conditions of peptides were optimized as phosphate buffer （50 mmol/L， pH 3.0） at 18 kV running voltage， with capillary length of 43 cm