黑粉病菌對薏苡生長及其細胞壁降解酶活性變化的影響

莫熙禮， 吳彤林， 李松克， 李本華， 江厚成， 武華文

(黔西南民族職業技術學院， 貴州 興義 562400)

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黑粉病菌對薏苡生長及其細胞壁降解酶活性變化的影響

莫熙禮， 吳彤林， 李松克， 李本華， 江厚成， 武華文

(黔西南民族職業技術學院， 貴州 興義 562400)

為了解薏苡黑粉病菌的致病性機制，對種子接種黑粉病菌后的發芽率和幼芽生長抑制作用、黑粉病菌在薏苡不同生長期的侵入危害及接種黑粉病菌后薏苡種子分泌產生的角質酶、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性變化進行測定。結果表明：黑粉病菌對種子的發芽無抑制作用，對幼芽的生長有一定的抑制作用；接種黑粉病菌孢子后，種子發病率為75.7%，而葉片和穗部的發病率都低于10%；病原菌處理種子后，角質酶的活性在6 h和12 h出現峰值，略高于對照，其余時間角質酶活性與對照差異不明顯，且角質酶的含量和活性均較低；細胞壁降解酶的活性測定發現，種子接觸黑粉病菌后，果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性與對照的PMG活性差異不顯著，且活性的變化率相同；多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24 h內迅速升高，達到峰值，之后迅速下降，與健康植株(CK)的活性差異不顯著，且變化規律相同。

薏苡; 黑粉病; 發病率; 種子發芽率; 幼芽生長抑制; 細胞壁降解酶活性

薏苡黑粉病是一種真菌性病害，由薏苡黑粉菌屬黑粉病菌(Ustffagocoic-sbref)引起，是我國薏苡生產上危害最重的病害之一，可使產量下降30%～50%，嚴重時減產80%。近年來，隨著我國薏苡種植規模的擴大，薏苡黑粉病大面積頻繁發生，而且呈逐年上升趨勢，已成為薏苡生產的重要制約因素。目前，國內外有關薏苡黑粉病的發生規律、生物學特性、致病機制等方面的研究尚未見報道，僅在防治方面有部分報道[1-3]。角質層和細胞壁是植物病原菌成功入侵植物需克服的兩道屏障，植物病原物則是通過合成和分泌各種細胞壁降解酶，降解植物體表的角質，降低植物自身的防御能力，利于病原菌的侵入[4-5]。筆者從薏苡黑粉病菌的侵入時期、侵入部位以及病菌產生的角質酶、果膠酶、纖維素酶的活性分析等方面，研究黑粉病菌的侵入關鍵時期、關鍵部位以及病原菌分泌產生各類致病相關酶在致病過程中所起的作用，為研究薏苡黑粉病菌的致病性機制以及薏苡黑粉病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

薏苡品種為晴薏白03-6，由黔西南民族職業技術學院吳彤林教授提供。

薏苡黑粉病菌采集于黔西南州農作物科學研究所薏苡示范基地。在薏苡果實上采集分離得到病瘤，風干后存放于紙盒內，于4℃冰箱保存備用。使用前將病瘤碾碎并過40目篩，得到菌粉，用蒸餾水將菌粉配成厚垣孢子濃度為1×104的懸浮液備人工接種。

1.2 種子發芽率和幼芽生長試驗

薏苡種子經5%石灰水浸種24 h后，取出用清水清洗干凈并晾干。將種子放入雙層濾紙的大培養皿中培養，用1×104孢子懸浮液噴霧種子，噴霧量為濾紙濕透，以蒸餾水為對照。將培養皿置于25℃黑暗恒溫箱中培養48 h(露白)后統計種子發芽數，計算萌發率。露白后，將培養皿放入25℃的光照培養箱內培養48 h，并測量幼芽的長度，每次隨機測量10顆種子幼芽的長度，每個處理5次重復。

發芽率=(發芽種子數/測定總種子數)×100%

1.3 黑粉病菌對薏苡不同生育期的侵入試驗

薏苡接菌時間設3個處理(時期)，分別為種子露白期、薏苡4葉期和薏苡抽穗期。處理1(種子+接菌)，薏苡種子經5%石灰水浸種24 h，取出用清水清洗干凈并晾干，放入有雙層濾紙的大培養皿中，置于25℃黑暗恒溫箱中培養48 h，露白后接種濃度為1×104的孢子懸浮液，接種的量以全部種子表面形成水膜為宜。處理2(葉片+接菌)，薏苡4葉期接種濃度為1×104的孢子懸浮液，噴施的量以全部葉片上剛形成水滴為宜。處理3(抽穗+接菌)，在薏苡抽穗期接種濃度為1×104的孢子懸浮液，噴施的量以穗部剛形成水滴為宜。各處理均以清水作對照(CK)，每處理3次重復。收獲期統計各處理黑粉病的發病株數，并計算發病率。

發病率=(發病的株數/各處理的總株數)×100%

1.4 種子接菌處理后細胞壁降解酶活性的變化試驗

1.4.1 角質酶 稱取1 g處理后的種子，加入4 mL的角質酶提取液，冰浴研磨，4℃,1 000 r/min離心10 min，取上清液即為角質酶的粗提取液。角質酶提取液配制及角質酶活性的測定參考吳潔云[6]的方法，分別測定處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h角質酶活性的變化。以1 mg酶蛋白1 min內吸光值為酶單位(U/mg)。

1.4.2 果膠酶 酶粗液的提取方法同1.4.1，果膠酶提取液的配制、多聚半乳糖酸酶(PG)以及果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的測定參考李寶聚[7]的方法。分別測定處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h多聚半乳糖酸酶(PG)以及果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性的變化。50℃酶解30 min，以1 h/mg蛋白催化底物產生1 μmol還原糖所需的酶量(U/mg)為1個酶活力單位。

1.4.3 纖維素酶 酶粗液的提取方法同1.4.1。纖維素酶提取液的配制、β-1,4-內切葡聚糖酶(EG)活性和β-葡聚苷酶的活性的測定參考董小梅[8]的方法。分別測定處理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)活性和β-葡聚苷酶活性的變化。50℃酶解30 min，以1 h/mg蛋白催化底物產生1 μmol還原糖所需的酶量(U/mg)為一個酶活力單位。

以上試驗均以牛血清蛋白作標準曲線。

2 結果與分析

2.1 黑粉病菌對薏苡的發芽率和幼芽生長的影響

由表1看出，黑粉病菌孢子懸浮液處理后，種子的發芽率為87.21%，與清水對照相比差異不顯著。而病菌孢子懸浮液處理后，幼芽的生長長度為17.35 cm，明顯低于清水對照。說明，黑粉病菌對薏苡種子的發芽率無影響，而對幼芽生長有一定的抑制作用。

表1 黑粉病菌孢子懸浮液處理薏苡的發芽率和幼芽長度

Table 1 Germination rate and bud length of Coix lacrymajobi withUstffagocoic-sbrefspore suspension

項目Items發芽率/%Germinationrate幼芽長度/cmBudlength黑粉病菌Ustffagocoic-sbref87.2117.35清水(CK)Clearwater89.5619.54

2.2 黑粉病菌在薏苡不同生育期的侵入情況

從表2看出，黑粉病在薏苡生長的不同時期其危害程度不同。其中，種子+接種黑粉病菌孢子處理的薏苡黑粉病在抽穗期的發病率達75.7%，而葉片+接菌和抽穗+接菌處理的發病率均低于10%。表明，薏苡黑粉病菌主要為種子侵入，不能或很少從葉片和穗部侵入危害。

表2 薏苡不同生育期接種黑粉病菌后的發病率

圖示 接種黑粉菌后種子角質酶、多聚半乳糖酸酶、果膠甲基半乳糖醛酸、β-1,4-內切葡聚糖酶和β-葡聚苷酶的酶活

Fig. Cutinase, polygalacturonase (PG), polymethyl galacturonate (PMG), β-1,4-endoglucanase(Cx) and β-galactosidase activity of Coix lacrymajobi seeds inoculated withUstffagocoic-sbref

2.3 接菌后薏苡種子細胞壁降解酶活性的變化

由圖示看出，種子接菌后：1) 角質酶。種子角質酶的活性在6 h和12 h出現峰值略高于對照，其余時間差異不明顯。在整個檢測周期，角質酶的含量和活性都較低。說明，角質酶在薏苡黑粉病菌的侵入過程中可能不起作用。2) 細胞壁果膠酶。多聚半乳糖酸酶(PG)活性能迅速升高，在24 h達到峰值，以后逐漸下降，且活性顯著高于對照。說明，PG酶在黑粉病菌侵入薏苡過程中起重要作用。果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性在6 h出現，之后逐漸的下降，但變化幅度小，與對照間差異不顯著，且活性的變化率相同。由此推斷，PMG酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽過程中起的作用可能較小。3) 纖維素酶。種子接菌后，β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)活性在12 h時迅速升高，顯著高于對照，之后逐漸下降，且變化規律與對照相同；對照的β-1,4-內切葡聚糖酶活性在整個檢測階段無顯著的變化。由此判斷，β-1,4-內切葡聚糖酶在黑粉病菌侵入薏苡幼芽后12 h起重要的作用。種子接菌后，β-葡聚苷酶的活性迅速升高，在24 h達峰值，此后下降與對照的β-葡聚苷酶活性相差不大。說明，β-葡聚苷酶在黑粉病菌侵入種子幼芽24 h內起重要作用。

3 結論與討論

1) 黑粉病主要危害薏苡的幼芽，侵染時期限于二葉期之前，芽生長長度超過20 cm后，其危害的幾率迅速下降[9]。本試驗結果也表明，孢子懸浮液對種子的發芽無抑制作用，對幼芽的生長具有一定的抑制作用。種子接觸黑粉病菌孢子后，收獲時期薏苡果實的黑粉病發病率為75.7%，而葉片和穗部接觸病菌孢子后，引起薏苡黑粉病發病率都低于10%。因此，判斷薏苡黑粉病菌主要從種子侵入危害，不能或很少能從葉片和穗部入侵。

2) 角質層是阻止病原真菌侵入寄主植物的第一道屏障，很多植物病原菌通過合成和分泌角質酶迅速降解寄主植物的角質，降低其防御能力，以達到侵害目的[2]，且病原物的致病性與角質酶的表達量呈正相關[10]。本研究發現，病原菌處理種子后，角質酶的活性在6 h和12 h出現峰值略高于對照，其余時間角質酶活性與對照差異不明顯，且角質酶的含量和活性都較低。低含量和低活性的角質酶可以沖破幼芽薄薄的一層角質層，侵入到薏苡的幼芽組織中。而出土后的薏苡葉片和穗部表面的角質層較厚，且常常附有一層蠟質層，因此，低濃度和低活性的角質酶不能沖破這一道屏障。這可能是黑粉病菌不能或很少能侵入薏苡的葉片和穗部的原因。

3) 植物病原真菌要成功地侵入寄主植物，必須刺穿細胞壁，即病原真菌侵入的第二道屏障。很多植物病原真菌通過分泌細胞壁降解酶降解細胞壁(果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶)，從而達到危害寄主植物的目的[3]。本研究對細胞壁降解酶活性的測定發現，種子接觸黑粉病菌后，果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性與對照的PMG活性差異不顯著，且活性變化率相同，這可能是PMG在黑粉病菌侵入幼芽過程中不起作用；而多聚半乳糖酸酶(PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)和β-葡聚苷酶的活性在24 h內迅速升高達到峰值，之后迅速的下降與健康(CK)的植株的活性差異不顯著，且變化規律相同。說明黑粉病菌24 h內大量分泌各種細胞壁降解酶破壞組織細胞壁侵入寄主細胞，且侵入薏苡幼芽后，并沒有短時間內迅速破壞寄主組織或者從組織中獲取大量的養分，而是與幼嫩的組織共存，隨著生長點向上移動,這可能是種子感染黑粉病菌后，葉片很少發現病癥，而穗部的癥狀很嚴重的原因。其作用方式和作用機理有待更深一步的研究。

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(責任編輯： 聶克艷)

Effects ofUstffagocoic-sbrefon Growth and Cell Wall Degrading-enzyme Activity ofCoixlacrymajobi

MO Xili, WU Tonglin, LI Songke, LI Benhua, JIANG Houcheng, WU Huawen

(QianxinanVocationalandTechnicalCollegeforNationality,Xingyi,Guizhou562400,China)

The activity of cutinase and cell wall degrading enzymes (polymethyl galacturonase PMG, polygalacturonase PG, β-1,4-endoglucanase Cx and β-galactosidase) ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefwas detected to understand the pathogenicity mechanism and study effects ofUstffagocoic-sbrefon seed germination rate and bud growth. The results showed thatUstffagocoic-sbrefhas no inhibition effect on seed germination and a certain inhibition effect on bud growth. The disease rate ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefis 75.7% but disease rate ofUstffagocoic-sbrefleaves and spikes is lower than 10%. The cutinase activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculatedUstffagocoic-sbrefreaches the peak value after 6 h and 12 h respectively, slight higher than CK. There is no obvious difference in cutinase activity but the cutinase content and activity both are lower during other time. PMG activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefis no difference with CK and the variation rate of PMG activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefand CK is the same. The PG, Cx and β-galactosidase activity ofCoixlacrymajobiseeds inoculated withUstffagocoic-sbrefreaches the peak rapidly within 24 h, then drops rapidly and finally is no difference with healthy plants of CK.

Coixlacrymajobi;Ustffagocoic-sbref; disease rate; seed germination rate; growth inhibition; young buds; activity of cell wall degrading-enzyme

2014-12-18； 2015-06-22修回

貴州省星火計劃項目“薏苡標準化栽培技術示范推廣”[黔科合農字(2013)5035];貴州省科技計劃項目“貴州省薏苡工程技術研究中心” [黔科合農字(2012)11]

莫熙禮(1982-)，男，講師，碩士，從事植物病蟲害防治教學和研究。E-mail:moxili1982@163.com

1001-3601(2015)07-0367-0080-03

S436.6

A