流式細胞術(shù)在蔬菜倍性鑒定中的應(yīng)用

成 妍，馬蓉麗，焦彥生，吳海濤

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，山西太原030032）

蔬菜作物倍性鑒定在遺傳育種中具有十分重要的作用。通過花藥（小孢子）、未受精子房再生出的植株，一般是倍性水平不同的混合群體，進行有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進一步應(yīng)用的基礎(chǔ)。倍性鑒定可用來檢測三倍體無籽西瓜、甜瓜的種子純度。另外，倍性鑒定也可用于細胞分裂等生理活動分析和遺傳效應(yīng)研究。蔬菜作物傳統(tǒng)的倍性鑒定方法有田間植株性狀調(diào)查法、花粉母細胞染色體計數(shù)法、根尖染色體計數(shù)法、花粉粒大小判別法和氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法等。

流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）倍性鑒定是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種以流式細胞儀為工具的倍性鑒定方法。流式細胞儀能快速測量細胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、蛋白質(zhì)、RNA、抗原等，并可對其分類、收集。FCM借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)，同時利用了計算機技術(shù)、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細胞化學(xué)、細胞免疫學(xué)等多門高新技術(shù)的發(fā)展，將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光，使之具有更好的單色性與激發(fā)效率，大大提高了檢測靈敏度。同時，將固定的標(biāo)本臺改為流動的單細胞懸液，用計算機進行數(shù)據(jù)處理，大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性，而且從同一個細胞中可以同時測得多項參數(shù)，被譽為是細胞分析領(lǐng)域的“CT”[1-2]。

目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)研究領(lǐng)域，但在蔬菜遺傳育種工作中的應(yīng)用還很少。全面、系統(tǒng)地了解流式細胞術(shù)是十分必要的，因此，筆者對它的原理、操作步驟、優(yōu)缺點及其在蔬菜作物倍性鑒定中的應(yīng)用進展進行了綜述。

1 流式細胞術(shù)倍性鑒定的原理

DNA熒光試劑可定量結(jié)合在DNA雙鏈的碳架結(jié)構(gòu)上，細胞核內(nèi)DNA分子數(shù)目越多，DNA分子鏈越長，熒光試劑嵌入碳架結(jié)構(gòu)中的量就越多，經(jīng)激光照射，這些DNA猝發(fā)熒光的強度也就越強。因此，在同一條件下，經(jīng)熒光試劑處理的細胞核DNA所發(fā)熒光強度的強弱，反映了細胞核DNA含量的高低[3]。

常用的熒光試劑有PI（碘化丙碇）、PE（藻紅蛋白）、FITC（異硫氰酸熒光素）、PerCP（多甲藻 -葉綠素）和CY5（花青苷）等。

樣本的細胞群體被分散染色后，在鞘液的包圍和約束下，細胞排成單列，以1個細胞/（m·s）的速度（1 000萬細胞/h）由流動室噴嘴噴出，形成細胞液柱。當(dāng)液柱通過檢測區(qū)時，在入射的激光束垂直照射下產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號。計算機把測量到的各種信號進行處理，將分析結(jié)果可顯示在計算機屏幕上，也可以打印出來或以數(shù)據(jù)文件的形式存儲在硬盤上，以備日后的查詢或進一步分析[4]。

2 流式細胞術(shù)倍性鑒定的步驟

2.1 樣品制備

將新鮮材料置于含有對DNA特異性的熒光試劑DAPI或PI緩沖液內(nèi)，用解剖刀切碎（也可以研磨或剪碎），懸浮液經(jīng)20～40 μm尼龍網(wǎng)過濾，調(diào)整細胞核密度至10萬～30萬個/mL。

2.2 儀器調(diào)試

打開電源，對系統(tǒng)進行預(yù)熱；打開氣體閥，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；利用標(biāo)準(zhǔn)樣品（通常為雞血紅細胞）進行校準(zhǔn)，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0°和90°散射的熒光強度最強，并要求變異系數(shù)為最小。

2.3 上樣測定

選定流速、測量細胞數(shù)、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，直觀掌握測量進程。樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)。因為實驗數(shù)據(jù)已存入計算機硬盤（有的機器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此，可關(guān)閉氣體測量裝置，單獨使用計算機進行數(shù)據(jù)處理。

2.4 結(jié)果分析

由于DNA含量與熒光信號強度呈正比關(guān)系，細胞核的倍性最后以C或n值表示，所以，1C表示細胞核單倍體，2C表示細胞核二倍體，依此類推。

3 流式細胞術(shù)倍性鑒定的優(yōu)缺點

流式細胞術(shù)倍性鑒定可以在短時間內(nèi)高速分析上萬個細胞，同時對許多樣本的大量細胞核DNA含量進行測定，DNA含量變異可在分布圖上直觀地看出。與傳統(tǒng)的熒光鏡、電子顯微鏡檢查相比，其具有速度快、分辨率高、數(shù)據(jù)可重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，制樣簡單，試材用量很少（50 mg左右），不影響植物正常生長等優(yōu)點，這對于經(jīng)細胞融合獲得的多倍體細胞團塊的早期鑒定具有更大的應(yīng)用價值；采用染色體計數(shù)只能對少量細胞進行統(tǒng)計分析，無法全面判斷嵌合體的倍性水平，而應(yīng)用流式細胞術(shù)倍性鑒定結(jié)果更準(zhǔn)確。

其缺點是：目前國際上還沒有一個統(tǒng)一的測量植物核DNA含量的標(biāo)準(zhǔn)作為參照，使用不同的內(nèi)標(biāo)進行DNA絕對含量測定，結(jié)果存在誤差；使用不同的核熒光染料檢測，結(jié)果也有明顯的差異；檢測費用較大，一般育種單位難以承受。

4 流式細胞術(shù)在蔬菜作物倍性鑒定中的應(yīng)用

Cao等[5]利用流式細胞儀（Partec CAII CHEM UNEX）鑒定2個小白菜品種的游離小孢子培養(yǎng)再生植株的倍性，表明2個群體均有自然加倍單倍體存在，但不同品種的小孢子植株中單倍體比率不同。周元昌等[6]采用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的流式細胞儀以抱子甘藍的花培苗群體為材料，采用DNA流式細胞儀測定法和形態(tài)學(xué)鑒定法鑒定其倍性組成，結(jié)果表明，DNA流式細胞儀測定法可鑒別群體的各種倍性水平，而形態(tài)學(xué)鑒別法可把群體中的二倍體與單倍體、四倍體及其他多倍體分開。

顧宏輝等[7]用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的流式細胞儀鑒定早熟菜苔品種油青四九小孢子再生植株的染色體倍性，結(jié)果表明，油青四九再生植株中單倍體比率為14%，自發(fā)二倍體的比率達到70%，四倍體比率為8%，以及少量的（不到8%）其他多倍體（如三倍體、六倍體）和混倍體（如單倍體加二倍體、二倍體加四倍體）。Gu等[8]對小白菜和烏塌菜的小孢子后代進行流式細胞儀倍性分析表明，70%以上的再生植株發(fā)生了自然加倍，其中包括自然加倍的四倍體。

陳斌等[9]采用FACSCalibur流式細胞儀，應(yīng)用Mod Fit分析軟件對7個甜椒F1和3個辣椒F1的花藥培養(yǎng)的再生株在幼苗期進行了倍性鑒定。流式細胞儀的矩形圖中清楚顯示出每份材料葉片的DNA含量，即檢測出單倍體、二倍體、三倍體或單倍體加二倍體的混倍體。研究表明，流式細胞儀可快速準(zhǔn)確地檢測出試材的染色體倍性，并與坐果結(jié)子的鑒別結(jié)果相一致。韓陽等[10]用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的DNA流式細胞儀對大白菜小孢子植株群體的倍性變異進行觀察，并以染色體計數(shù)法的鑒定結(jié)果為依據(jù)進行研究，結(jié)果表明，DNA流式細胞儀鑒定法的準(zhǔn)確率94.44%，可用于大白菜小孢子群體倍性鑒定。

韓毅科等[11]用FACSCalibur流式細胞儀對經(jīng)抗微管除草劑胺磺靈加倍處理過的黃瓜進行倍性鑒定，研究表明，與染色體計數(shù)法相比，用流式細胞測定法能迅速測定黃瓜葉片單個細胞核內(nèi)DNA含量，根據(jù)含量的峰值能準(zhǔn)確推斷細胞的倍性，且流式細胞術(shù)特別適合離體培養(yǎng)的小植株進行倍性鑒定。張振超等[12]利用美國Beckman公司的流式細胞儀測定經(jīng)秋水仙素處理過的不結(jié)球白菜倍性，以普通二倍體材料作為對照，對照的DNA相對含量為100，疑似株的DNA為200，表明其是四倍體；疑似株有2個值，與對照的比值約為1和2，表明其是嵌合體（2x＋4x）。流式細胞儀鑒定結(jié)果與染色體計數(shù)法鑒定結(jié)果一致，表明流式細胞儀可較準(zhǔn)確地檢測不結(jié)球白菜突變株的倍性。馬麗華等[13]利用FACSCalibur流式細胞儀，通過自動分析、檢測細胞DNA含量的分離峰，來鑒定不結(jié)球白菜小孢子再生植株的染色體倍性，研究發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜自然加倍率很高，且倍性變異情況比較復(fù)雜，其中，四倍體植株占比例最高，達到56.39%；二倍體植株占39.10%；三倍體植株占3.01%；而單倍體植株僅占1.50%。

成妍等[14]采用美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL型流式細胞儀測定不結(jié)球白菜小孢子再生植株的DNA含量，以普通二倍體材料作為對照，結(jié)果表明，不結(jié)球白菜小孢子再生植株自然加倍率總體水平較高，有的高達90%，但不同基因型間有明顯差異。鄧耀華等[15]先利用流式細胞儀對甘藍小孢子植株進行倍性鑒定，以此作為依據(jù)，再利用普通光學(xué)顯微鏡觀察已通過倍性鑒定的雙單倍體與單倍體的氣孔保衛(wèi)細胞，測定其大小與葉綠體數(shù)，研究表明，氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)是鑒定甘藍小孢子植株倍性的簡易有效手段。

方淑桂等[16]采用德國Partec GmbH公司生產(chǎn)的PA-I流式細胞儀對不同熟性的大白菜小孢子植株群體的倍性變異進行測定，結(jié)果表明，小孢子植株是倍性水平不同的混合群體，不同熟性的大白菜小孢子植株群體的倍性分布不同，中晚熟大白菜小孢子植株雙單倍體比例最高，春大白菜最低。周志國等[17]使用德國Partec GmbH公司的流式細胞儀對蘿卜游離小孢子再生植株的葉片和莖等進行了測定，發(fā)現(xiàn)小孢子誘導(dǎo)出的植株中同時出現(xiàn)了單倍體、雙單倍體、四倍體植株。與父母本相比，單倍體的峰值出現(xiàn)在75附近，二倍體的峰值出現(xiàn)在150附近，四倍體峰值出現(xiàn)在300附近。施先鋒等[18]采用德國Partec GmbH公司的PA-I流式細胞儀對西瓜倍性進行早期鑒定，結(jié)果顯示，二倍體植株主峰熒光強度位于50 AU，而四倍體主峰熒光強度位于100 AU，說明四倍體植株細胞DNA含量為二倍體的2倍。

5 展望

迄今，流式細胞術(shù)已應(yīng)用于多種蔬菜作物倍性鑒定，與其他傳統(tǒng)鑒定方法相比具有不可替代的優(yōu)勢，流式細胞術(shù)被認為是最有前途的倍性鑒定方法。隨著相關(guān)研究的不斷深入，這項技術(shù)將會越來越完善，應(yīng)用會更加方便、快捷，檢測結(jié)果會更加準(zhǔn)確。

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