食品中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

廉慧鋒，宋 潔，張文娟，宋 歡

（1.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局，山西太原030024；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

阿維菌素類藥物（Avermectins，AVMs）是由鏈霉素（streptomyces avermitilis）產(chǎn)生的一組類似于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的物質(zhì)，由于有殺蟲活性強(qiáng)[1-2]、殺蟲譜廣的特點(diǎn)，成為現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)上用量最大的抗寄生蟲藥物[3]。目前，已商品化的主要品種有阿維菌素（Avermectin，AVM）、伊維菌素（Ivermectin，IVM）、多拉菌素（Dommectin，DOR）、埃普菌素（Eprinomectin，EP）、莫西丁克（Moxidectin，MOX）和塞拉菌素（Selamectin，SEM）。

AVMs屬于微生物源農(nóng)藥，對(duì)大鼠的LD50為10 mg/kg，與對(duì)硫磷的LD50（3.5～12.5 mg/kg）相仿[4]。AVMs作為脂溶性藥物，在動(dòng)物體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖能力存在著潛在的毒性[5]。按世界衛(wèi)生組織5級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，將其列為高毒農(nóng)藥[6]。隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生活水平的提高，食品安全問(wèn)題引起了全社會(huì)的廣泛重視。幾乎每個(gè)國(guó)家都有食品中AVMs殘留限量的規(guī)定，美國(guó)、歐盟、日本和中國(guó)等均制定了AVMs的最高殘留限量（MRL）。中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定其在柑橘、梨和黃瓜中的MRL值為20 μg/kg，葉菜和豇豆中的MRL值為50 μg/kg；歐盟規(guī)定在果蔬、谷物等農(nóng)產(chǎn)品中MRL值為10 μg/kg；韓國(guó)規(guī)定其在蘋果中的MRL值為20 μg/kg，芹菜為50 μg/kg；以色列規(guī)定其在黃瓜、茄子、桃子、草莓等果蔬產(chǎn)品中的MRL值為10 μg/kg；澳大利亞規(guī)定在蘋果、梨、番茄等產(chǎn)品中的MRL值為10 μg/kg；國(guó)際食品法典委員會(huì)規(guī)定在蘋果、梨、柑橘、瓜類等產(chǎn)品中的MRL值為10 μg/kg[7]。筆者就近年來(lái)有關(guān)阿維菌素的分析方法研究作一簡(jiǎn)要綜述。

1 前處理方法

阿維菌素類藥物的凈化方法包括液液萃取、固相柱萃取（SPE）、固相基質(zhì)分散（MSPD）以及超臨界流體萃取等方法。其中，SPE凈化方法為常用的凈化方法，學(xué)者們采用不同類型的SPE柱，都取得了較好的效果。

1.1 液液萃取法

梁振益等[8]在測(cè)定蔬菜與水果中阿維菌素殘留量時(shí)，用液液萃取法凈化了蔬菜（青瓜、菠菜）與水果（梨）的樣品提取液。張侃侃等[9]測(cè)定甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在水稻植株、稻米、稻田水樣及土壤中的消解動(dòng)態(tài)和最終殘留時(shí)，用液液萃取法凈化了由丙酮-水、二氯甲烷提取的水稻、稻米和土壤的樣品液。

1.2 固相基質(zhì)分散法（MSPD）

Barker等[10]對(duì)固相基質(zhì)分散法（MSPD）在分析化學(xué)上分離和提取固體、半固態(tài)或高黏性生物樣品的應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)的介紹。張倩等[11]對(duì)MSPD各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和設(shè)計(jì)，建立了4種蔬菜中阿維菌素的MSPD前處理法。

1.3 超臨界流體萃取法（SFE-HPLC-RLD）

Danaher等[12]建立了動(dòng)物肝臟中阿維菌素、伊維菌素、依立菌素和多拉菌素的多殘留超臨界流體凈化方法。李珠柱等[13]采用超臨界流體技術(shù)能有效地把模型藥物阿維菌素吸附到多孔空心結(jié)構(gòu)中，吸附量可達(dá)61.5%。

1.4 固相柱萃取法（SPE）

繆琪等[14]建立了固相柱萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC），檢測(cè)枸杞中阿維菌素B1a殘留量的方法，樣品用乙腈提取，經(jīng)C18固相萃取柱凈化，采用C18柱分離。張?jiān)频萚15]在對(duì)鰻魚的測(cè)定中用堿性氧化鋁柱對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化去脂。

2 檢測(cè)技術(shù)

AVMs在食品中的殘留量極微[16]，須選擇特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快的檢測(cè)方法。儀器分析技術(shù)的準(zhǔn)確性、精密性與免疫分析技術(shù)的簡(jiǎn)便快捷相結(jié)合，該聯(lián)合技術(shù)應(yīng)用日趨廣泛，同時(shí)多殘留分析技術(shù)也是AVMs殘留分析技術(shù)的發(fā)展方向。AVMs分子質(zhì)量大，極難氣化，目前尚無(wú)可行的氣相色譜衍生化方法，無(wú)法采用氣相色譜分析。

阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)方法中酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）靈敏度較高，操作簡(jiǎn)單快速，但重復(fù)性不好，且不易標(biāo)準(zhǔn)化。高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）前處理較簡(jiǎn)單，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，但由于其檢測(cè)限較高，一般多用于阿維菌素類藥物制劑的檢測(cè)。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FLD）的檢測(cè)限低，干擾少，是目前使用最廣泛的阿維菌素類藥物殘留的檢測(cè)方法[17]。但液相色譜-熒光檢測(cè)法需要繁瑣的衍生化反應(yīng)，前處理較為復(fù)雜，檢測(cè)的特異性和靈敏性也不強(qiáng)，耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，具有高選擇性、高靈敏性、前處理簡(jiǎn)單易行的高效液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法（HPLC-MS）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）將逐步成為阿維菌素類藥物殘留分析的主流方法[18]。

2.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC是以液體為流動(dòng)相的一種色分離技術(shù)，采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)及高效微粒固定相（粒度5～10 μm)，從而在分離速度、分離效能、靈敏度、定性定量、可靠性等方面都達(dá)到和氣相色譜法相媲美的程度，保持了液相色譜對(duì)樣品適用范圍廣、流動(dòng)相可選擇的種類多等特點(diǎn)。

AVMs的共軛二烯結(jié)構(gòu)在λ=240～250 nm處有強(qiáng)烈的紫外吸收，利用此特點(diǎn)，可建立紫外檢測(cè)，但在此光譜區(qū)域存在著皮質(zhì)激素、維生素、脂類、酸等眾多內(nèi)源性物質(zhì)，嚴(yán)重地干擾了AVMs的色譜分析[19]，因此，紫外測(cè)定法并不適合AVMs的殘留分析。但熒光衍生化方法檢測(cè)卻可彌補(bǔ)紫外測(cè)定方法的不足。熒光檢測(cè)法使檢測(cè)的選擇性和靈敏度顯著提高，檢測(cè)限較紫外法低約1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，可滿足AVMs殘留分析需要，但該方法對(duì)樣品凈化要求比較嚴(yán)格。

目前，關(guān)于熒光檢測(cè)方法[20]的報(bào)道比較多。侯曉林等[21]采用高效液相色譜分離，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，建立了固相萃取分析牛組織中埃普利諾菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素殘留的方法，樣品用乙腈提取，堿性氧化鋁和C18-SPE柱凈化，用乙酸酐和1-甲基咪唑的乙腈溶液作衍生化試劑，96℃條件下，完全衍生化需要100 min，衍生化反應(yīng)繁瑣，前處理較為復(fù)雜。Berendsen等[5]也從有機(jī)化學(xué)的角度用HPLC-FLD法針對(duì)牛奶中的阿維菌素類藥物的多殘留進(jìn)行了新的定性和定量分析。

2.2 酶聯(lián)免疫法（ELISA）

HPLC方法雖然取得了很好的試驗(yàn)結(jié)果，卻需復(fù)雜的前處理過(guò)程和昂貴的儀器。因而，各國(guó)學(xué)者紛紛致力于檢測(cè)技術(shù)的推陳出新，其中免疫技術(shù)的發(fā)展，為此提供了新的契機(jī)。免疫分析法是將免疫反應(yīng)與現(xiàn)代測(cè)試手段相結(jié)合而建立的超微量測(cè)定方法。免疫分析法有熒光免疫測(cè)定法、酶免疫測(cè)試法、放射免疫測(cè)定法[22]。

ELISA主要以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，依靠比色來(lái)確定農(nóng)藥殘留情況的檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)是生物酶技術(shù)與免疫分析技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域的一門新技術(shù)，目前已有部分特異性的酶聯(lián)免疫試劑盒投入使用[23]。ELISA和免疫學(xué)方法與儀器分析方法不同，它可使分析過(guò)程簡(jiǎn)化，適合復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分析、大批量樣品的篩選。由于AVMs藥物是半抗原，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，需與大分子載體物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）相結(jié)合制備人工抗原，免疫動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，然后建立免疫競(jìng)爭(zhēng)法。趙衛(wèi)東等[24]用酶聯(lián)免疫法（ELISA），建立定量檢測(cè)動(dòng)物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留的方法。免疫分析檢測(cè)具有一定的盲目性，以及抗體依賴于國(guó)外進(jìn)口等因素的影響，使酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用范圍受到較大的限制[23]。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）

試驗(yàn)證明，液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）分析大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有快速、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)沒(méi)有紫外吸收特征的抗生素以及對(duì)有交叉組分的抗生素具有良好的完全分離和定性分析的能力。所以，LC-MS是AVMs的理想確證方法，一般檢測(cè)限可達(dá)到2～5 ng/g，在5～100 μg/kg之間回收率可達(dá)70%～94%[25]。

Dureden[26]在電噴霧電離（ESI）模式下，比較了幾種阿維菌素類藥物產(chǎn)生正負(fù)離子的行為特征，建立了牛奶中阿維菌素類藥物多殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，其檢測(cè)低限僅為0.5 μm/L。Hemandom等[27]采用液相色譜線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，測(cè)定了鮭魚肉等食品中阿維菌素類藥物殘留，定量下限0.1～5 μg/kg。Sherdan等[28]研究報(bào)道了牛奶中5種AVMs驅(qū)蟲劑，即伊維菌素、阿維菌素、依立菌素、莫西菌素和米爾倍霉素的多殘留檢測(cè)方法。此方法使用簡(jiǎn)單的液液萃取，后用液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS-MS）進(jìn)行定性、定量分離檢測(cè)。

此外，近幾年來(lái)在我國(guó)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)阿維菌素類藥物的研究和檢測(cè)也有了長(zhǎng)足的進(jìn)展。楊方等[29]建立了采用超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)茶葉中愛(ài)比菌素、甲胺基阿維菌素、乙酰胺基阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和莫西丁克6種藥物殘留的檢測(cè)方法。董靜等[30]建立了動(dòng)物源性食品中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、莫西菌素、埃普菌素、乙酰胺基阿維菌素6種阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法穩(wěn)定、可靠，可滿足動(dòng)物源性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)與確證的需要。高華鵬等[31]建立了同時(shí)快速測(cè)定鰻魚中AVM，DOR，IVR的超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。趙東豪等[32]建立了以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)豬肉中阿維菌素、多拉菌素及伊維菌素3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的分析方法。

3 發(fā)展趨勢(shì)

綜觀AVMs的檢測(cè)技術(shù)，其發(fā)展趨勢(shì)是向確證方法和多殘留分析方向發(fā)展，研究主要集中在3個(gè)方面，即快速篩選方法的建立、樣品前處理方法的改進(jìn)和對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行確證。液質(zhì)聯(lián)用殘留檢測(cè)技術(shù)除具有高度的選擇性和靈敏度，并且對(duì)凈化要求低，可以同時(shí)進(jìn)行定性確證和定量檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便、操作性強(qiáng)，且有良好的準(zhǔn)確性和精密性，使得分析過(guò)程簡(jiǎn)化，適合復(fù)雜樣品中的痕量分析。正由于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)集色譜的高分離能力、質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性于一體，已逐漸成為當(dāng)代最重要的分離和鑒定分析方法之一。

［1］賈變桃，劉鵬琰，賈虎，等.10種殺蟲劑對(duì)小菜蛾室內(nèi)生物活性比較[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（1）：67-68.

［2］謝燕楠，陸凱文，鐘方紅，等.阿維菌素對(duì)稻飛虱防效及對(duì)天敵的影響[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2009（2）：58.

［3］Tsukamoto Y，Cole L M，Casida J E.Avermectin chemistry and action:ester-and ether-type candidate photoaffinity probes[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry，2000，8（1）：19-26.

［4］Sanderson H，Laird B，Pope L，et al.Assessment of the environmental fate and effects of ivermectin in aquatic mesocosms[J].Aquatic Toxicology，2007，85（4）：229-240.

［5］Berendsen BJ A，Mulder P P J，van Rhijn H J A.The derivatisation of avermectins and milbemycins in milk:New insights and improvement of the procedure[J].Analytica Chimica Acta，2007，585（1）：126-133.

［6］王學(xué)臣，袁廷城，韓福友，等.10.5%阿維菌素·毒死蜱乳油防治蘋果樹(shù)桃小食心蟲田間藥效試驗(yàn) [J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，15（Z1）：2.

［7］孫明娜，王梅，段勁生，等.阿維菌素殘留檢測(cè)技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（12）：2778-2779，2842.

［8］梁振益，李嘉誠(chéng)，羅盛旭，等.高效液相色譜法測(cè)定蔬菜與水果中阿維菌素殘留量[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2005，4（4）：20-22.

［9］張侃侃，胡德禹，張鈺萍，等.甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在水稻環(huán)境中的殘留及消解動(dòng)態(tài) [J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（2）：190-194.

［10］Barker S A.Matrixsolid phase dispersion（MSPD）[J].Journal of Biochemical and Biophysical MethodsSample Preparation，2007，70（2）：151-162.

［11］張倩，杜海云，馮磊，等.MSPD-HPLC/MS（ESI）法測(cè)定蔬菜中的阿維菌素[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（20）：110-114.

［12］ Danaher M，Howells L C，Crooks S R H，et al.Review of methodology for the determination of macrocyclic lactone residues in biological matrices[J].Journal ofChromatography：B，2006，844（2）：175-203.

［13］李珠柱，文利雄，黎穎，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化空心多孔SiO2納米球?qū)Π⒕S菌素的吸附條件 [J].過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2006，6（1）：82-86.

［14］繆琪，孔祥虹，韓舜愈，等.SPE-HPLC法測(cè)定枸杞中阿維菌素 B1a殘留量[J].分析試驗(yàn)室，2007，26（7）：97-99.

［15］張?jiān)疲荆惡纾?液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定鰻魚中阿維菌素和伊維菌素殘留量[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（Z1）：104-107.

［16］ Mascari T M，F(xiàn)oil L D.Oral treatment of rodents with ivermectin for the control of Phlebotomus papatasi（Diptera:Psychodidae）under laboratoryconditions[J].Veterinary Parasitology，2010，171（1/2）：130-135.

［17］XUQ，XIANGW.Developmentand validation ofan HPLC-FLD method for milbemectin quantification in dog plasma[J].Journal ofChromatography：B，2010，878（22）：2013-2017.

［18］Benincasa C，Perri E，Iannotta N，et al.LC/ESI-MS/MS method for the identification and quantification of spinosad residues in olive oils[J].Food Chemistry，2011，125（3）：1116-1120.

［19］Pollmeier M，Maier S，Moriarty K，et al.High-performance liquid chromatographic assay for the determination of a semisynthetic avermectin analog（eprinomectin）in bovine milk at parts per billion levels—method development and validation[J].Journal of Chromatography B：Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences，2002，772（1）：99-105.

［20］張艷，吳銀良，胡繼業(yè)，等.高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定蔬菜中殘留的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽[J].色譜，2008，26（1）：110-112.

［21］侯曉林，何繼紅，杜向黨，等.牛肝中阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜熒光檢測(cè)方法的研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（5）：500-503.

［22］熊文山.農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)技術(shù)與方法 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2007（5）：50-51.

［23］王彥娟，靳燁，云戰(zhàn)友，等.牛乳中農(nóng)藥殘留的安全性檢測(cè)[J].農(nóng)產(chǎn)品加工：學(xué)刊，2007（1）：80-82，85.

［24］趙衛(wèi)東，鄭文杰，賀艷，等.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)動(dòng)物源性產(chǎn)品中阿維菌素殘留 [J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30（4）：127-129.

［25］Danaher M，O'Keeffe M，Glennon J D.Extraction and isolation of avermectins and milbemycins from liver samples using unmodified supercritical CO2with in-line trapping on basic alumina[J].Journal ofChromatographyB:Biomedical Sciences and Applications，2001，761（1）：115-123.

［26］ Durden D A.Positive and negative electrospray LC-MS-MS methods for quantitation ofthe antiparasitic endectocide drugs，abamectin，doramectin，emamectin，eprinomectin，ivermectin，moxidectin and selamectin in milk[J].Journal of Chromatography：B，2007，850（1/2）：134-146.

［27］ Hernandom，Suareaj，Buenoam，et al.Fast separation liquid chromatography-tandem mass spectmmetry for the confimation and quantitative analysis of avemectin residues in food[J].J chromatogr：A，2007，1155：62-73．

［28］ Sherdan R，Desjardins L.Determination of abamectin doramectin emamectin，Eprinomectin and moxidectin in milk by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J].J AOACInt，2006，89（4）：1088-1094.

［29］楊方，楊守深，林永輝，等.超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)茶葉中阿維菌素類藥物殘留 [J].色譜，2009，27（2）：153-157.

［30］董靜，宮小明，張立，等.QuEChERS-高效液相色譜法檢測(cè)蔬菜中的吡蟲啉、蟲酰肼、阿維菌素和噻螨酮[J].分析試驗(yàn)室，2008，27（3）：91-94.

［31］高華鵬，張健玲，李永夫，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定鰻魚中阿維菌素類農(nóng)藥殘留 [J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2008，29（6）：337-342.

［32］趙東豪，賀利民，聶建榮，等.豬肉組織中阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定 [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（8）：862-865.