人Parkin基因重組質粒的構建

李普陽,夏學巍＊,李 勇,張 偉

(1桂林醫學院附屬醫院,廣西桂林 541001;2桂林醫學院)

研究發現[1],在帕金森病(PD)患者的黑質中存在泛素—蛋白酶體途徑(UPP)的功能異常,這可能是PD發病的核心機制。Parkin、DJ-1等作為泛素蛋白的配體,對細胞可起到保護作用。2008年 9月 ～2010年 5月,我們應用分子生物學技術構建了人Parkin基因重組質粒,旨在為PD的基因治療用于臨床奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 總RNA抽提試劑Trizo1,RT-PCR試劑盒。引物由上海生工公司合成,上游為(Cla I)5′-CCATCGATCCACCTACCCAGTGACCA-3′,下游為(Xba I)5′-GCTCTAGACCCATACAGATACATGGATTGCA-3′;克隆載體pUCm-T,菌株DH5α;限制性內切酶、TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶。

1.2 方法

1.2.1 胎兒黑質組織的獲取及其總RNA的提取從 18周自然流產男性胎兒提取黑質組織(由臨床醫院捐贈,并經家屬簽署知情同意書),研缽中加入液氮研磨組織塊;取50～100mg,加入1 ml Trizol勻漿,冰上靜置5min。加入200μl氯仿,震蕩15 s,靜置2 min。4℃12 000 g離心15min。取上清,加入500μl異丙醇,將液體混勻,冰上靜置 10 min。4℃12 000 g離心10min。棄上清,加入75%乙醇1 ml,洗滌2次。4℃7 500 g離心 5min,棄上清。晾干后,加入 100μl DEPC中,65℃孵育促溶 10～15 min。

1.2.2 目的cDNA片段的獲取 冰上配置RT反應液,5×Prime Script Buffer 2μl,Prime Scrip t RT Enzyme MixⅠ0.5μl,Oligo dT Primer(50μM)0.5 μl,Random 6mers(100μM)0.5μl,總RNA 500 ng,加RNase Free dH2O水至10μl,37℃15 min進行逆轉錄反應,85℃5 s使得反轉錄酶失活。擴增目的基因:冰上配置PCR反應液,SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)12.5μl,PCR Forward Primer(10μM) 1μl,PCR Reverse Primer(10μM)1μl,RT反應液2 μl,滅菌蒸餾水 8.5μl,總體積為25μl。95℃變性1m in,61℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,10個循環。95℃變性1 min,59℃退火1min,72℃延伸3m in 30 s,10個循環。95℃變性1 min,57℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,10個循環。95℃變性1 min,58℃退火1min,72℃延伸3min 30 s,5個循環。72℃充分延伸 10 min。4℃終止反應。

1.2.3 重組質粒的構建 取PCR產物0.1μg,10 ×Taq DNA聚合酶1μl,PCR緩沖液1μl,5mmol/ L dATP 0.4μl,Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.1μg,加去離子水至總體積 10μl,充分混勻。混合物于70℃孵育1 h。取加A尾PCR產物0.2 pmol,1μl pUCm-T載體,1μl 10×ligation Buffer,1μl 50% PEG,最后加入1μl T4 DNA Ligase,補充去離子水至10μl,充分混勻,20℃連接1 h。

1.2.4 連接產物的轉化及篩選 取 100μl感受態細胞,置冰上。完全解凍后將細胞均勻懸浮。加入5μl連接液混勻,冰上放置30min。42℃熱休克90 s,冰上放置15～20 min。加入400μl SOC培養基, 37℃200～250 r/min振蕩培養1 h。室溫下4 000 r/m in離心5 min,吸掉400μl上清液,用剩余的培養基將細胞懸浮。將細菌涂布在預先用20μl IPTG和100μl X-gal涂布的氨芐青霉素平板上,37℃下正向放置1 h,然后倒置培養過夜。選擇在平板上生長的白色菌落,用牙簽挑至含氨芐青霉素的液體培養基,37℃培養過夜。

1.2.5 重組質粒的酶切鑒定及測序 隨機挑取白色菌落,接種于2 ml含氨芐西林(50 mg/L)的LB培養基中,振蕩培養;小量提取質粒,用XbaⅠ和ClaⅠ酶切檢測,瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察酶切結果。送上海生工公司用M13通用引物和T7啟動子引物對PCR產物進行測序。用ABI 100 Model 377自動測序儀進行全序列測序。

2 結果

2.1 總RNA提取結果及RT-PCR擴增產物 提取出總RNA后,測OD值。OD值介于1.8～2.0,RNA提取質量較好。在紫外燈下觀察總RNA電泳,可見28 S、18 S和5 S三個條帶,28 S和18 S亮度之比為2∶1,5 S條帶較弱,說明 RNA無降解。逆轉錄得到cDNA第1鏈,用合成的Parkin上、下游引物進行PCR反應,得到約 1 785 bp的特異性片段,初步鑒定為人Parkin cDNA。

2.2 PCR產物的克隆的鑒定及測序結果 用XbaⅠ和ClaⅠ酶切可見有1 778 bp,初步鑒定提示有Parkin cDNA的插入。挑選陽性克隆在自動測序儀下測序,結果經Medline Blast查詢,與Gene Bank [NM 004562]所登錄序列完全一致。

3 討論

Parkin基因定位于6q25.2～27,位于遺傳標記D6S305和D6S253之間。全長1.5 Mb,有12個外顯子,編碼序列為1 395 bp,所編碼蛋白含465個氨基酸。其是泛素和蛋白的 E3連接酶,能與 E2 UbcH7和UbcH8共同作用,而且Parkin自身也是經泛素化調節降解。Parkin編碼蛋白在正常人的腦部廣泛表達,特別是黑質區,而PD患者腦內缺乏Parkin蛋白表達;一旦Parkin變性,可影響某些蛋白降解,從而引起多巴胺類神經元的毒性損傷,導致常染色體隱性少年型帕金森病(ARJP)[2]。Parkin蛋白作為一種泛素—蛋白連接酶參與蛋白降解[3,4]。一般大腦中的Parkin蛋白并不以天然的α-synuclein為底物將其泛素化,而是與結構上發生改變的 αsynuclein蛋白,如翻譯后加工的(O端糖基化或磷酸化)、構象改變的(原纖維的纖維化或多聚化)發生作用。Parkin基因突變常導致Parkin蛋白缺失,功能障礙,酶活性減弱或消失,造成細胞內異常蛋白累積,最終導致多巴胺能神經元死亡[5,6]。所以,Parkin蛋白在泛素—蛋白水解酶復合體通路中發揮重要作用,是一種多用途的神經保護劑。

本實驗擴增到的特異性片段約為 1 395 bp,與預期片段太小相符;連接入克隆載體后,經Pst I酶解,與片段內部酶切位點相符,初步鑒定為Parkin cDNA。測序結果表明該片段與Gene Bank報道完全相符,故可確認為Parkin cDNA。此外,在合成引物時加入的Cla I和Xba I酶切位點對今后亞克隆提供了基礎,pUCm-T載體具有T7啟動子,可用來合成原位雜交的探針,為今后的工作奠定基礎。

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