新型層析快速檢測技術及其在食品安全中的應用

劉道峰鄧省亮賴衛華

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330029）

新型層析快速檢測技術及其在食品安全中的應用

劉道峰1鄧省亮2賴衛華1

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330029）

分別介紹量子點、熒光微球、上轉磷光、納米磁珠為代表的新型標記物免疫層析，非免疫學層析，替代抗原層析等新型層析快速檢測技術，綜述其原理、優勢及其在食品安全相關領域的應用現狀，并對今后層析檢測方法的發展趨勢進行展望。

新型；層析檢測；食品安全；應用

目前，以膠體金標記為代表的免疫層析方法已廣泛應用于食品安全相關檢測中。膠體金（colloidal gold）是氯金酸在還原劑的作用下，形成可控大小的金顆粒，在試紙條上金顆粒聚集達到一定密度時，能出現肉眼可見的粉紅色，因而膠體金可以標記生物分子并作為免疫層析反應的指示物。目前，對于膠體金免疫層析檢測方法，中國已初具產業化規模并有較多成熟產品問世，如：檢測鹽酸克侖特羅試紙條靈敏度已達到2ng/mL，萊克多巴胺檢測限已達到3ng/mL。

類似常用的還有膠體硒、乳膠微球等吸收光譜型標記物［1－3］，但由于這些傳統層析檢測方法有一定弊端，如此類物質物易受光學干擾，僅能定性或半定量分析，且要求標記物大量聚集至一定濃度后才能產生可視的信號（如膠體金需達到107個/mm2，才會形成肉眼可見的紅色［4］），因此，這也限制了傳統層析方法在食品安全領域的廣泛應用。

1 新型標記物免疫層析法及其在食品安全中的應用

目前，已經應用于免疫層析標志物的新型納米材料包括量子點（quantum dots，QDs）、熒光微球、上轉磷光納米粒子（up－converting phosphor，UCP）、納米磁珠等幾大類。這些新興的標記方法有效規避了吸收光譜型標記物須大量聚集才能顯色的缺點，也有效減少了樣本的本底干擾，在層析檢測中顯示了更大的潛力。

1.1 量子點標記免疫層析

量子點（quantum dots，QDs）又稱熒光半導體納米顆粒，用于生物探針的量子點主要由第二副族和第六主族的元素組成，如硒化鎘（CdSe）、硫化鋅（ZnS）、碲化鎘（CdTe）、硫化鎘（CdS）等［5］。粒徑多介于1～10nm，極小的粒徑，外觀似點狀，故得名為量子點。

受量子尺寸效應和量子限域效應的影響，半導體量子點顯示出獨特的發光特性［6］，主要表現在：① 其發光特性除了與量子點的材料相關外還與其顆粒尺寸密切相關，一定范圍內，粒徑越大，發射光的頻率越低，波長越長；② 激發光譜很寬，可以使用小于其發射波長10nm的任意波長激發光來激發量子點，而量子點的發射光譜譜峰較窄且無拖尾，單色性好，因此可以用同一激發光源來激發不同的量子點，這使得在同一系統中同時檢測多個項目中量子點有了極大優勢；③量子點有著很大的Stoke位移，可有效避免激發光與發射光的重疊，這使得發射光的判別更為明顯，檢出更為容易，更有利于提高檢測靈敏度；④ 量子點具有遠大于生物分子的熒光壽命，在大部分生物分子熒光猝滅后，可以有效地降低自然本底的干擾。此外，經一系列化學修飾后的量子點可以擁有穩定的水溶特性與更好的生物相容性［7－9］。經穩定的核殼包裹的量子點也顯示出更好的光化學穩定性與更低的細胞毒性。所以，近年來在食品安全相關的層析檢測中受到了研究者較熱門的關注，有著較廣泛的應用［10，11］。

Zou等［12］報道了一種新的檢測有機磷農藥－毒死蜱（三氯吡啶醇，trichloropyridinol）殘留的傳感器，該傳感器基于量子點標記免疫層析方法并結合一便攜式量子點層析試紙條的讀取儀。據讀取儀掃描T線（檢測線）量子點光強度，可以將檢測結果定量化，在最佳條件下，該傳感器有較寬的線性范圍，標準品最低檢出濃度為1.0ng/mL。實現了以量子點標記免疫層析為基礎的待測物的“超靈敏”定量分析。Tully等［13］也將量子點標記免疫層析方法應用于單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）外膜蛋白的檢測，驗證了抗Int A及Int B兩組蛋白的單抗對李斯特氏菌檢出的有效性，對李斯特氏菌的最低檢出濃度為1.5×104CFU/mL。張國華等［14］應用該方法檢測萊克多巴胺（ractopamine，Rac），所得的Rac快速檢測試紙條的檢測限為3ng/mL。Peng等［15］通過量子點－BSA－生物素－親和素－抗體作為結合墊探針，建立了能同時檢測5種化學物殘留的間接競爭免疫層析法，其中，地塞米松（dexamethason，DEX）的定量檢測線性范圍為0.33～10μg/kg，慶大霉素（gentamicin，GM）0.28～10μg/kg，氯硝安定（clonazepam，CZP）為0.16～25μg/kg，頭孢噻呋（ceftiofur，CEF）0.32～25μg/kg，甲孕酮（medroxyprogesterone acetate，MPA）0.17～10μg/kg，同時檢測上述物質的最低檢出濃度：DEX，0.13μg/kg；GM，0.16μg/kg；CZP，0.07μg/kg；CEF，0.14μg/kg；MPA，0.06μg/kg。檢測加標豬肉樣本并與傳統方法比對，準確性較高，顯示了量子點在體系中同時檢測多種物質的優勢。

1.2 熒光微球標記免疫層析

熒光微球是指將熒光染料通過物理吸附法、自組裝法、化學鍵合法、共聚法、包埋法等［16］方法吸附或包埋到粒子內而形成的直徑在納米至微米級（0.01～10μm）范圍內，受激發光源激發能發出熒光的固體微粒。在微球殼結構的作用下，它具有相對穩定的形態結構，粒度均一、單分散性好、穩定性好、發光效率高、重復性好，有較好的生物相容性。形成微球后染料熒光猝滅大大減少，發射強而穩定，且基本不受外界環境介質變化的影響［17］。

Nathalie等［18］以包裹磺酰羅丹明B的微球為標記物的免疫層析方法檢測葡萄球菌腸毒素B，整個檢測時間為30min，在緩沖液中檢測限接近20pg/mL，加標于不同樣本基質，靈敏度依然能夠得到保持，優于相同條件膠體金標記層析法（0.312ng/mL）約15倍，加之，因熒光微球有效防止了熒光染料向溶液中泄露，檢測限更優于直接標記羅丹明染料的層析方法（0.625ng/mL），該方法與其他主要細菌毒素均無交叉反應，展示了熒光微球標記免疫層析的明顯優勢。范放等［19］以熒光納米顆粒為標記物，研制了檢測O139群霍亂弧菌的免疫層析試紙條，用該試紙條檢測人工污染O139群霍亂弧菌的海魚肉，檢測靈敏度為3.5×104CFU/mL，比前人［20］的膠體金免疫層析試紙條3.4×105高一個數量級。朱海等［21］將熒光微球與呋喃唑酮代謝物單克隆抗體共價耦聯在一起，以競爭法作為反應模式來制備出呋喃唑酮代謝物免疫層析試紙條，所制備的免疫層析試紙條僅與呋喃唑酮代謝物AOZ有交叉反應，而與非目標檢測物之間無交叉反應，其靈敏度達1.0ng/mL，可滿足相關檢測標準要求，通過肉眼觀察檢測線和質控線之間的亮度，還可進行半定量檢測。

1.3 上轉磷光標記免疫層析

上轉磷光材料（up－converting phosphor，UCP）是新近發展起來的一種示蹤納米晶體顆粒材料，由包埋于氧化硫等惰性材料中的兩種不同鑭系元素離子（分別作為光吸收子和發射子）組成［22］。在紅外線（波長＞780nm）激發下，上轉磷光顆粒吸收2個或2個以上光子的低能量，并可發射更高能譜（更高頻率）不同區段單波長的可見光（波長475～670nm），故為上轉磷光［23］。由于上轉磷光顆粒猝滅的時間更長和天然生物材料不具備上轉磷光的特性［24］，所以檢測可不受載體或樣品自然磷光的干擾；加之，磷光上轉發生于晶格中，故磷光顆粒的光學性質不受環境和加樣條件的限制，使得上轉磷光免疫層析技術靈敏度高，應用范圍廣。

王靜等［25］建立了一種腸出血性大腸桿菌O157的上轉磷光免疫層析快速檢測方法，每次最低可檢測500個細菌，對奶粉、咖啡粉、餅干、蛋糕、綠豆糕、果凍、燕窩、果汁等樣品中的人工染菌均可檢測，最低檢測濃度為5×103CFU/mL。高于常規膠體金免疫層析試紙條10～100倍［26，27］，體現了上轉磷光免疫層析方法簡便快速，特異性和靈敏性好，適用于現場的快速檢測的優勢。郭艷宏等［28］合成了稀土銪2SiO2納米顆粒，用其與氯霉素單克隆抗體結合制備氯霉素類殘留物免疫檢測探針，并制備免疫層析試紙條，用于牛奶中氯霉素和氯霉素琥珀酸鹽同步檢測，簡便快速，30min內出結果。加入1ng/mL的氯霉素、氯霉素琥珀酸鹽均能阻斷T線顯色，與甲砜霉素、慶大霉素、磺胺二甲基嘧啶之間無交叉反應，特異性好，未發現非特異性吸附和基質背景熒光干擾的問題。Niedbala等［29］采用研制的UCP標記雙抗夾心免疫層析法對E.coliO157∶H7進行檢測，在含有109雜菌的25g牛肉陰性樣本基質中最低加入的103CFU/mL目的菌，可在10min內被檢出，且0到107CFU/mL間的變異系數均小于10%，穩定性好。同時也采用UCP標記競爭免疫層析法對多種興奮劑進行檢測，結果理想。Hong等［30］研制的檢測鼠疫耶爾森氏菌抗體的10通道上轉磷光免疫層析試紙條裝置，可以同時檢測多種鼠疫耶爾森氏菌抗體，與ELISA對照檢測表現了較高的符合率 （R2＝0.93～0.99），平均變異系數為10.3%，表現了較好的穩定性。

1.4 納米磁珠標記免疫層析

目前對指示物的檢測基本上都是靠肉眼觀察定性結果或者基于光電效應的儀器檢測，在檢測過程中，無論是肉眼還是光學儀器檢測NC膜上T線和C線（質控線）上的信號，基本上只能檢測到膜表面到其10μm以下的部分。通常使用的硝化纖維膜厚度為100μm級別，指示物質在纖維膜上層析時在整個膜上從底到頂均有分布，這樣多達90%的指示物未被測量到，這對于檢測的靈敏度是個極大的損失。納米磁性顆粒（magnetic nanoparticle，MNs）現已被廣泛應用于生物分離，酶的固定化，細胞的特異性捕獲、濃縮等領域［31，32］，目前正在被嘗試著用于取代傳統免疫層析技術中指示物質。由于納米磁性顆粒的“穿透性”，儀器對磁珠的磁信號檢測可以不受膜的厚度的影響，能夠檢測膜上從底到頂所有的磁珠，便可有希望大大提高靈敏度。加之，食品生物類材料大都不具備磁性，選擇磁性顆粒標記可有效避免本底干擾。

袁航［33］建立了磁標記用于大分子的雙抗夾心及用于小分子的競爭免疫層析檢測法，其中磁標記競爭免疫層析法以鹽酸克倫特羅（clenbuterol）為目標物質，分別達到了現有ELISA 方法的靈敏度（0.5ng/mL），而檢測時間縮短至20min，與成熟使用的膠體金檢測試紙比對，所測107例樣本，符合率達到100%，優于參比的產品。這確認了納米磁珠標記免疫層析方法及其應用于食品安全檢測的有效性。Wang等也進行了相關的研究［34］，結果表明，磁珠標記層析的檢測時間主要跟磁珠粒徑相關，而信號的強度主要由磁珠中磁性物質的含量有關，選用更小粒徑與磁性物質含量更高的磁珠作免疫層析的標記物更有利于快速、靈敏度的納米磁珠標記免疫層析。

2 新型非免疫學層析及其在食品安全中的應用

近年來互補的核酸鏈之間的特異性結合，也被研究者應用于層析方法中，新的物質也可以被層析的方法檢出，由于它們的結合力更強、特異性更高而有望從反應動力學上提高檢測靈敏度。

Wang等［35］利用核酸與核酸之間的特異性結合，通過量子點標記層析法對赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）進行檢測。檢測原理：結合墊用量子點標記一段核酸配子（核酸單鏈），而在T線噴涂能與該配子大部分區段特異性互補的另一條核酸鏈Probe1，C線再噴涂一條Probe2。當樣本中存在OTA時，經過結合墊，會與標記量子點的配子作用，導致配子無法與T線（檢測線）的Probe1雜交，而不顯顏色，由于量子點標記配子的5′端有一段18個堿基的poly A，故無論樣本是否含有OTA，配體都會與C線上的Probe2相結合，使C線顯色，保證檢測有效。該新型的層析方法檢測限低至1.9ng/mL，完全滿足WHO對OTA的限量要求。量子點標記配體的思路使檢測的靈敏度高于膠體金免疫層析，更重要的是極高的選擇性使方法尤其適于對復雜樣本溶液的檢測。

再如，商品化的 Milenia GenLine HybriDetect試劑盒，適用于任何擴增產物快速檢測。只需要在設計擴增時，設計一條FITC標記的探針，和生物素標記的引物。其檢測原理為生物素標記的PCR產物與FITC標記的特異探針雜交、FITC標記的特異探針與抗FITC抗體的金標物結合后，將該免疫復合物滴加到試紙條上，免疫復合物通過層析膜擴散到檢測線時，生物素標記的擴增產物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的T線。不被捕獲的免疫復合物繼續擴散到質控線被特異性抗體所捕獲，形成具有顏色的C線。已有研究者［36］將此層析方法結合環介導等溫核酸擴增（LAMP）技術應用于轉基因作物的快速檢測，方便、快捷、成本低廉，有效增補了中國轉基因食品的快速檢測方法，有良好的應用前景。

3 新型替代抗原層析及其在食品安全中應用

當前，對于食品中有毒有害小分子抗原的層析檢測方法通常是建立在以噴涂該小分子或蛋白－小分子偶聯物作競爭抗原基礎上的有毒檢測體系。由于多數檢測物標品昂貴、進口受限，毒性抗原還存在對層析檢測產品的生產及使用操作人員的健康產生危害等問題，如黃曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OTA）等毒性強烈且標品難以獲得，制約了層析檢測方法的應用和推廣。

20世紀80年代發展起來的噬菌體展示肽庫技術，為傳統的免疫學分析方法提供了新的思路?？蓪⒖箼z測物的抗體作為靶分子，從噬菌體展示肽庫中淘選出抗原的模擬表位，利用抗原模擬表位和目標分子能競爭結合抗體的特性，在層析檢測系統中可以采用模擬表位替代傳統的偶聯抗原，從而達到檢測的目的。

Lai等［37］建立了以模擬表位肽為競爭物的膠體金標免疫層析法，10ng/mL的OTA樣本可在10min內被此方法檢出，T線以篩選的模擬表位肽替代了OTA－BSA的復合物，避免了真菌毒素OTA的使用，為真菌毒素的免疫層析檢測嘗試了新的方法。

目前，關于模擬肽的篩選及其在免疫檢測中的應用已成為研究的熱點，相信有更多的成功篩選會被應用于層析檢測方法中。

4 展望

在食品安全領域，高靈敏度、高選擇性、多樣性、定量化已成為層析檢測方法的主流方向與發展趨勢。如何使這些新技術更快地實現產業化并應用于實踐，滿足國家對不同樣品及不同待檢測物進行檢測的要求，將成為研究者努力的方向。

1 張艷.尿微量白蛋白膠體硒試紙條的初步制備［D］.蘭州：蘭州大學，2009.

2 謝成綱.酶聯免疫法與血清乳膠層析法檢測乙肝兩對半結果的分析［J］.中國中醫藥咨訊，2011，3（7）：141.

3 張金燕，王緒國，張萍，等.談3種不同方法檢測乙型肝炎病毒血清標志物的體會［J］.中外醫療，2010，29（18）：186.

4 吳剛，姜瞻梅，霍貴成，等.膠體金免疫層析技術在食品檢測中的應用［J］.食品工業科技，2007，28（12）：216～218.

5 Byers R J，Hitchman E R.Quantum dots brighten biological imaging［J］.Progress in Histochemistry and Cytochemistry，2011，45（4）：201～37.

6 Yang Q，Gong X，Song T，et al.Quantum dot－based immunochromatography test strip for rapid，quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein［J］.Biosensors and Bioelectronics，2011，30（1）：145～150.

7 Hu X，Gao X.Silica－polymer duallayer－encapsulated quantum dots with remarkable stability［J］.ACS Nano，2010，4（10）：6 080～6 086.

8 Chan W C W，Nile S M.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection ［J］.Science，1998，281（5 385）：2 016～2 018.

9 宋冰，程軻，武超，等.CdS量子點的制備和光學性質［J］.材料研究學報，2009，23（1）：152～156.

10 曾慶輝，張友林，安利民，等.CdTe/CdS量子點的Ⅰ－Ⅱ型結構轉變與熒光性質［J］.高等學校化學學報，2009，30（6）：1 158～1 161.

11 Hu X，Gao X.Silica polymer dual layer－encapsulated quantum dots with remarkable stability［J］.ACS Nano，2010，4（10）：6 080～6 086.

12 Zou Z，Du D，Wang J，et al.Quantum dot－based immunochromatographic fluorescent biosensor for biomonitoring trichloropyridinol，a biomarker of exposure to chlorpyrifos［J］.Analytical Chemistry，2010，82（12）：5 125～5 133.

13 Tully E，Hearty S，Leonard P，et al.The development of rapid fluorescence－based immunoassays，using quantum dot－labelled antibodies for the detection of Listeria monocytogenes cell surface proteins［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2006，39（1－3）：127～134.

14 張國華，賴衛華，熊勇華，等.量子點標記免疫層析試紙條快速檢測萊克多巴胺的研究［J］.食品科學，2009，30（12）：254～257

15 Peng C，Li Z，Zhu Y，et al.Simultaneous and sensitive determination of multiplex chemical residues based on multicolor quantum dot probes［J］.Biosensors and Bioelectronics，2009，24（12）：3 657～3 662.

16 張榮榮，徐自力.熒光微球的制備技術及其應用進展［J］.高分子通報，2009（1）：63～70.

17 吳偉兵，王明亮，景宜，等.單分散熒光微球的制備及其光學性能研究［J］.南京林業大學學報（自然科學版），2010，34（3）：15～19.

18 Khreich N，Lamourette P，Boutal H，et al.Detection of staphylococcus enterotoxin B using fluorescent immunoliposomes as label for immunochromatographic testing［J］.Analytical Biochemistry，2008，377（2）：182～188.

19 范放，朱海，洪小柳，等.O139群霍亂弧菌熒光納米顆粒試紙條的研制［J］.分子診斷與治療雜志，2010，2（1）：9～12.

20 王家豪，吳捷，許永炎，等.膠體金免疫層析法快速檢測霍亂弧菌的初步應用［J］.中國熱帶醫學，2001，1（1）：71～72.

21 朱海，范放，呂敬章，等.呋喃唑酮代謝物熒光納米顆粒免疫層析法的建立［J］.畜牧與飼料科學，2009，30（6）：32～34.

22 楊銀輝，祝慶余.上轉磷光技術在生物醫學檢測中的研究進展［J］.中華檢驗醫學雜志，2003，26（11）：704～705.

23 周蕾，紀軍，楊瑞馥，等.上轉磷光技術在快速生物分析中的應用［J］.生物技術通報，2003（3）：20～25.

24 Pires A M，Serra O A，Davolos M R.Yttrium oxysulfide nanosized spherical particles doped with Yb and Er or Yb and Tm：efficient materials for up－converting phosphor technology field［J］.Journal of Alloys and Compounds，2004，374（1－2）：181～184.

25 王靜，周蕾，李偉，等.上轉磷光免疫層析檢測腸出血性大腸桿菌O157［J］.中國食品衛生雜志，2007，19（1）：41～44.

26 Jung B Y，Jung S C，Kweon C H.Development of a rapid immunochromatographic strip for detection ofEscherichia coliO157［J］.J.Food Prot.，2005，68（10）：2 140～2 143.

27 黃嶺芳，段霞，陳媛，等.大腸桿菌O157：H7膠體金試紙條研制［J］.食品科學，2010，31（24）：355～359.

28 郭艷宏，李飛，鄒明強，等.用于檢測氯霉素類殘留物的熒光免疫檢測試紙條的研制［J］.化學試劑，2010，32（6）：496～498，517.

29 Niedbala R S，Feindt H，Kardos K，et al.Detection of analytes by immunoassay using up－converting phosphor technology［J］.Analytical Biochemistry，2001，293（1）：22～30.

30 Hong W，Huang L，Wang H，et al.Development of an up－converting phosphor technology－based 10－channel lateral flow assay for profiling antibodies against Yersinia pestis［J］.Journal of Microbiological Methods，2010，83（2）：133～140

31 Yang H，Qu L，Wimbrow AN，et al.Rapid detection of Listeria monocytogenes by nanoparticle－based immunomagnetic separation and real－time PCR［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，118（2）：132～138

32 Kim G－Y，Son A.Development and characterization of a magnetic bead－quantum dot nanoparticles based assay capable ofEscherichia coliO157：H7quantification［J］.Analytica Chimica Acta.，2010，677（1）：90～96.

33 袁航.羧基功能化超順磁性復合粒子的制備及其在免疫層析中的應用研究［D］.吉林：吉林大學，2010.

34 Wang Y，Xu H，Wei M，et al.Study of superparamagnetic nanoparticles as labels in the quantitative lateral flow immunoassay［J］.Materials Science and Engineering：C，2009，29（3）：714～718.

35 Wang L，Chen W，Ma W，et al.Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins［J］.Chemical Communications，2011，47（5）：1 574～1 576.

36 汪琳，羅英，周琦，等.核酸試紙條在檢測轉EPSPS基因作物中的應用［J］.生物技術通訊，2011，22（2）：238～242.

37 Lai W，Fung D Y C，Yang X，et al.Development of a colloidal gold strip for rapid detection of ochratoxin A with mimotope peptide［J］.Food Control.，2009，20（9）：791～795.

Application of novel chromatographic detection techniques for food safety

LIU Dao－feng1DENG Sheng－liang2LAI Wei－hua1

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China；2.Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang，Jiangxi330029，China）

The novel chromatographic detection techniques were introduced，represented by nonimmune chromatography，immunochromatography based on mimotope peptide and immunochromatography with new labels，such as quantum dots，fluorescent microsphere，upconverting phosphor and magnetic nanobeads，and their application for food safety.The principle，advantages，the trend and prospect for development of chromatographic detection in the future were also discussed in the paper.

novel；chromatographic detection；food safety；application

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.069

國家自然科學基金項目（編號：30960301）

劉道峰（1988－），男，南昌大學在讀碩士研究生。E－mail：defoelau＠163.com

賴衛華

2011－08－10