退火溫度對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)焓值的影響

周國(guó)燕 藍(lán) 浩 李紅衛(wèi)

（上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

退火溫度對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)焓值的影響

周國(guó)燕 藍(lán) 浩 李紅衛(wèi)

（上海理工大學(xué)生物系統(tǒng)熱科學(xué)研究所，上海 200093）

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）熱循環(huán)中，退火溫度的選取至關(guān)重要，該因素的稍微變化對(duì)PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生很大的影響，導(dǎo)致整個(gè)PCR的熱現(xiàn)象變化。通過(guò)差示掃描量技術(shù)（DSC）研究HBV在不同退火溫度時(shí)焓值隨循環(huán)數(shù)的變化。結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增在變性階段吸熱，在退火和延伸階段放熱，每一個(gè)PCR循環(huán)呈現(xiàn)放熱效應(yīng)，同時(shí)退火溫度高導(dǎo)致平臺(tái)期的前移和焓值的降低，53℃退火最佳。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；焓值；差示掃描熱量技術(shù)；退火溫度；循環(huán)數(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction，簡(jiǎn) 稱PCR），是一種體外快速擴(kuò)增特異 NA片段技術(shù)［1］，由Kary.B.Mullis等于1985年在PE－Cetus公司發(fā)明并命名。PCR雖然在設(shè)計(jì)上十分簡(jiǎn)單，但實(shí)際上是個(gè)非常復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，目前為止還是一種半經(jīng)驗(yàn)性的技術(shù)，此外PCR的高度敏感性導(dǎo)致任何因素的微小變化都會(huì)很大程度影響檢測(cè)結(jié)果，如假陰、假陽(yáng)性問(wèn)題和非特異擴(kuò)增［2］。故探索研究PCR的影響因素及控制方法很有必要。

PCR熱循環(huán)過(guò)程各階段溫度的選取對(duì)其擴(kuò)增結(jié)果的影響很大，其中退火溫度的高低不僅決定著反應(yīng)的特異性，也影響著反應(yīng)的擴(kuò)增效率。現(xiàn)有的研究［3，4］表明：退火過(guò)程首先是引物和模板形成復(fù)合物，其次形成引物－模板－酶三倍體復(fù)合物，該過(guò)程伴隨著化學(xué)鍵的不斷生成和斷裂，引起吸放熱現(xiàn)象的產(chǎn)生。Conceicao等［5］用等溫滴定法研究了模板引導(dǎo)DNA復(fù)制過(guò)程中的堿基插入和延伸時(shí)熱動(dòng)力學(xué)變化，結(jié)果表明酶促催化的堿基插入和DNA延伸過(guò)程是個(gè)放熱過(guò)程。此外，隨著循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增效率的變化以及引物二聚體等物質(zhì)的生成，引起的熱現(xiàn)象也不同，故可從量熱學(xué)角度研究退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。

差示掃描量熱術(shù)（differential scanning calorimetry，簡(jiǎn)稱DSC）指“在程序溫度下測(cè)量輸入到試樣和參比物的功率差與溫度關(guān)系的技術(shù)”，是最近幾年發(fā)展起來(lái)的量熱技術(shù)，對(duì)研究DNA精確復(fù)制有著十分重要的意義［6－11］。本試驗(yàn)依據(jù)PCR反應(yīng)的溫度特性，設(shè)置合理的DSC溫度掃描程序，在DSC上實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增，研究退火溫度為55，54，53，52℃時(shí)PCR擴(kuò)增各階段的熱流及其隨循環(huán)數(shù)的變化情況，探討了不同退火溫度的熱現(xiàn)象與PCR的假陰性和擴(kuò)增效率的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

模板：重組質(zhì)粒 pUC－19，每質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.5×103COPIES/μL，帶有HBV完整基因組，吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；

大腸桿菌JM109：吉林大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；

Taq DNA聚合酶、dNTP：大連寶生物工程有限公司；

質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒：杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司；

差示掃描量熱儀：DSC－Pyris Diamond，美國(guó) Perkin Elmer公司；

天平：BP－211D，賽多利斯公司；

其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 AXYGEN試劑盒提取質(zhì)粒

培養(yǎng)、收集含有重組質(zhì)粒pUC－19的大腸桿菌細(xì)胞［12］，回收和純化質(zhì)粒DNA。用紫外分光光度計(jì)測(cè)出質(zhì)粒濃度為96.9μg/mL（A260/A280＝1.80），計(jì)算出每質(zhì)粒的拷貝數(shù)為1.5×1010copies/μL，質(zhì)粒倍比稀釋得到本試驗(yàn)采用的質(zhì)粒濃度1.5×106copies/μL［13］。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GeneID：944568，設(shè)計(jì)擴(kuò)增HBV前C基因合適的引物。本試驗(yàn)所用的引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并純化。合成的HBV前C區(qū)基因引物序列：5′－TTT GGG GCA TGG ACA TTG AC－3′；5′－GCC TCG TCG TCT AAC AAC AG－3′。

1.4 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系組成如表1所示。

表1 PCR反應(yīng)體系組成Table 1 Reagent concentration in PCR experiment

1.5 DSC掃描程序

常溫下加樣，變性溫度為94℃，持續(xù)時(shí)間為0.8min；退火溫度依次為55，54，53℃，持續(xù)時(shí)間為0.8min；延伸溫度為72℃，持續(xù)時(shí)間為1.0min，30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)延伸時(shí)間增加3min。升降溫掃描速率都為200℃/min，冷卻采用Perkin－Elmer公司的二級(jí)制冷CryoFillTM；樣品沖洗氣體為高純度氮?dú)猓兌龋?9.999%），流量20mL/min保持不變；樣品皿為PE不銹鋼高壓皿。

2 結(jié)果與分析

將配制好的14μL PCR反應(yīng)體系于PE高壓皿中，采用上述1.5的DSC溫度掃描程序在DSC－Pyris Diamond上依次進(jìn)行退火溫度為55，54，53℃的PCR擴(kuò)增，得到各個(gè)循環(huán)的熱流隨時(shí)間變化圖。圖1為退火溫度54℃時(shí)的變化圖，圖中的溫度曲線A依次指示，a～b：從72℃以200℃/min的速率升溫至94℃，b～c：94℃恒溫0.8min，c～d：從94℃以200 ℃/min的速率降溫至54 ℃，d～e：54 ℃ 恒溫0.8min，e～f：從54℃以200℃/min的速率升溫至72℃，f～h：72℃恒溫0.8min。由圖1可知，b～c高溫變性階段為吸熱過(guò)程，而d～e低溫退火和f～h適溫延伸階段為放熱過(guò)程，與冉姝等的試驗(yàn)結(jié)果一致［14，15］。曲線B﹑C分別為第2個(gè)循環(huán)和第1個(gè)循環(huán)的熱流隨時(shí)間變化圖，從曲線可以看出PCR體系在b～c﹑d～f﹑f～h恒溫段熱流明顯發(fā)生變化，且曲線B比曲線C變化大。用曲線B減去曲線C得到PCR循環(huán)數(shù)為2和1的熱流差值隨時(shí)間變化曲線D，其中，b～c變性吸熱階段的熱焓差值為正，說(shuō)明第二個(gè)循環(huán)比第一個(gè)循環(huán)在變性階段吸收的熱量多，而d～c退火﹑f～h延伸放熱階段的熱焓差值為負(fù)，說(shuō)明第二個(gè)循環(huán)比第一個(gè)循環(huán)在退火﹑延伸階段放出的熱量多，這是由于第二個(gè)循環(huán)復(fù)制的DNA比第一個(gè)循環(huán)的多引起的。用DSC自帶的Pyris Software 5.0軟件采用標(biāo)準(zhǔn)基線得到該循環(huán)的焓值為128.761J/g，同樣的道理，得到不同退火溫度的各個(gè)循環(huán)的焓值，用Origin 7.0分析這些數(shù)據(jù)得到不同退火溫度時(shí)的焓值隨循環(huán)數(shù)變化圖，見(jiàn)圖2～4。

圖1 退火溫度為55℃時(shí)第一個(gè)循環(huán)和第二個(gè)循環(huán)的熱流變化圖Figure 1 The change of heat flow as cycle number is one when the annealing temperature is 55 ℃

圖2 退火溫度55℃時(shí)熱流密度隨循環(huán)數(shù)的變化圖Figure 2 The change of heat flow as cycle number raising when the annealing temperature is 55 ℃

退火溫度的選取對(duì)PCR反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增效率非常重要，一般來(lái)說(shuō)，較低的退火溫度可提高PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率但引物與模板間錯(cuò)配幾率增大，導(dǎo)致擴(kuò)增特異性較差，而較高的退火溫度則可提高PCR反應(yīng)的特異性但卻降低了其擴(kuò)增效率［16］。分析不同退火溫度的變化圖（1～4）可以得出：隨著退火溫度的降低，PCR反應(yīng)體系的焓值隨循環(huán)數(shù)的增加呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，其中退火溫度為55℃時(shí)，前5個(gè)循環(huán)的焓值變化很大，呈對(duì)數(shù)型，6～18間有很微弱的變化，但之后的差距變化不是很明顯，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的前移，說(shuō)明退火溫度較高，引物與模板結(jié)合的敏感性較差，導(dǎo)致引物沒(méi)有和模板很好地結(jié)合，降低PCR的擴(kuò)展效率，甚至檢測(cè)結(jié)果呈假陰性；當(dāng)退火溫度降到54℃時(shí)，雖然在0到17個(gè)循環(huán)，焓值變化隨循環(huán)數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增效應(yīng)，而17個(gè)循環(huán)數(shù)后變化不是很大，平臺(tái)效應(yīng)沒(méi)有前移，但平臺(tái)期的焓值比較小，說(shuō)明擴(kuò)增效率比較低；當(dāng)退火溫度為53℃時(shí)，PCR體系焓值隨循環(huán)數(shù)的增加呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增效應(yīng)和后期的平臺(tái)效應(yīng)，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程的焓值都比較大，說(shuō)明特異性和擴(kuò)增效率達(dá)到了預(yù)期的效果，故應(yīng)選取退火溫度為53℃。

圖3 退火溫度54℃時(shí)熱流密度隨循環(huán)數(shù)的變化Figure 3 The change of heat flow as cycle number raising when the annealing temperature is 54 ℃

圖4 退火溫度53℃時(shí)熱流密度隨循環(huán)數(shù)的變化Figure 4 The change of heat flow as cycle number raising when the annealing temperature is 53 ℃

從圖2～4的變化趨勢(shì)可以看出，不論退火溫度多少，PCR擴(kuò)增都要進(jìn)入“平臺(tái)效應(yīng)”，研究者從酶促擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)的角度進(jìn)行了相關(guān)的研究，可能的原因有：①DNA聚合酶活力的下降：PCR循環(huán)中最重要的因素是Tap－DNA聚合酶，雖然Tap－DNA聚合酶耐高溫不容易失活，但反復(fù)長(zhǎng)時(shí)間暴露在高溫，活力會(huì)逐漸降低［17］；②PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的增加，抑制了反應(yīng)的進(jìn)行［18，19］；③ 引物二聚體的形成：隨著循環(huán)數(shù)的增加，引物不僅和模板DNA結(jié)合，引物和引物間也相互結(jié)合形成引物二聚體，形成的引物二聚體不僅減少引物，同時(shí)也和ds－DNA競(jìng)爭(zhēng)引物和dNTP，導(dǎo)致反應(yīng)速率的降低［20］；④隨著循環(huán)數(shù)的增加，高溫下低濃度ds－DNA變性困難和低溫下模板再退火及退火延伸時(shí)間的延長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降。PCR擴(kuò)增是個(gè)復(fù)雜過(guò)程，受到諸多因素的影響，任何因素的微小變化都會(huì)很大程度上改變PCR擴(kuò)增的忠實(shí)性和特異性［21］，而開(kāi)始階段的反應(yīng)物濃度，熱循環(huán)條件微小變化和錯(cuò)配對(duì)產(chǎn)物的最對(duì)總產(chǎn)量影響極大［22］。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用DSC從量熱學(xué)方面研究不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響，試驗(yàn)表明：PCR擴(kuò)增在變性階段吸熱，而在退火和延伸階段放熱，每一個(gè)PCR循環(huán)呈現(xiàn)放熱效應(yīng)；不同退火溫度時(shí)的PCR焓值隨循環(huán)數(shù)變化趨勢(shì)不同，過(guò)高或過(guò)低都不能達(dá)到預(yù)期結(jié)果，在本試驗(yàn)HBV體系中，53℃ 退火時(shí)的結(jié)果最佳。

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Research on changes of PCR enthalpy in different annealing temperature with DSC

ZHOU Guo－yan LAN HaoLI Hong－wei

（Institute of Biosystem Thermal Science，Shanghai University of Science and Technology，Shanghai200093，China）

It is very important to select annealing temperature in PCR process，a little change of the factor may lead to huge impact on thermal phenomenon of PCR.In this paper，the HBV as the target gene in different annealing temperature was replicated，and the enthalpy was studied via DSC，the experiment results show：the denaturation phase of the reaction was endothermic process，and the annealing and extension phase were heat emission process，each circulation presents a exothermic effect；simultaneously high annealing temperature caused platform moving ahead and enthalpy reduction，and be best in 53℃.

PCR；enthalpy；DSC；annealing temperature；cycle number

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.006

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：50206013）；上海市教委科研創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：09YZ230）

周國(guó)燕（1970－），女，上海理工大學(xué)副教授，博士。E－mail：efly＿snow＠163.com

2011－08－01