兩株嗜酸乳桿菌體外降低膽固醇的研究

路四海 趙瑞香 祁婷婷

（河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

兩株嗜酸乳桿菌體外降低膽固醇的研究

路四海 趙瑞香 祁婷婷

（河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

考察兩株嗜酸乳桿菌體外降低膽固醇的降低曲線和降低方式，以及不同條件下嗜酸乳桿菌對培養(yǎng)基中膽固醇的降低情況。結(jié)果表明，這兩株菌對膽固醇有明顯的去除作用，其對膽固醇的降低作用是同化吸收和共沉淀的結(jié)果，以同化方式為主；隨著接種量的增加，降低率也隨之增加；不同膽鹽對其降低膽固醇效果不同，當膽鹽添加量為0.2%（m/V）時，膽固醇降低量最大；當吐溫80添加量為0.1%時，膽固醇降低效果最佳。

嗜酸乳桿菌；膽固醇；降低率

膽固醇（cholesterol）是一種具有環(huán)戊烷多氫菲的27碳化合物，為人類生存所必需的營養(yǎng)成分，具有重要的生理功能，它既是構(gòu)成細胞膜的重要成分，又可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化形成類固醇激素，并且是合成維生素D3的原料及膽汁酸的前體［1，2］。但是如果體內(nèi)積累過多的膽固醇也會對人體造成危害。大量的試驗研究［3］表明，嗜酸乳桿菌等乳酸菌能夠有效地降低血清及培養(yǎng)介質(zhì)中的膽固醇，并且嗜酸乳桿菌是一類具有益生作用的微生物，廣泛用于食品工業(yè)中。因此，開發(fā)出具有降低膽固醇保健作用的嗜酸乳桿菌食品具有很廣闊的市場前景。

本試驗就兩株嗜酸乳桿菌對體外膽固醇降低作用和方式，以及不同因素對其降膽固醇的影響進行了研究，以期對嗜酸乳桿菌保健食品的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

嗜酸乳桿菌Lactobacillus acidophilusind－1和ind－2（簡寫為la1和la2）：由波蘭羅茲技術(shù)大學食品化學與生物工程學院發(fā)酵工程與工業(yè)微生物系提供，河南科技學院食品學院分離、純化和保藏。使用前用MRS培養(yǎng)基活化，以4%的接種量在37℃培養(yǎng)20h，活化兩次以備試驗使用。菌株在實驗過程中置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基［4］：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸二銨2g，瓊脂粉10g，吐溫 80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，K2HPO42g，蒸餾水1 000mL調(diào)pH 6.2～6.4，121℃滅菌15min。

1.1.3 主要試劑

牛磺膽酸鈉：美國Sigma公司；

總膽固醇測定試劑盒：長春匯力生物技術(shù)有限公司；

膽酸、牛膽鹽：化學純，北京奧博生物技術(shù)有限責任公司；

膽固醇等其他試劑：均為分析純。

1.1.4 主要儀器

生化培養(yǎng)箱：SHP－250型，上海三發(fā)科學儀器有限公司；

超凈工作臺：SW－CJ，蘇凈集團安泰公司；

高速冷凍離心機：RC5C，美國杜邦公司；

手提式不銹鋼蒸汽消毒器：XY－280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司；

可見分光度計：7200型，尤尼克（上海）儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 含膽固醇 MRS（簡寫為 MRS－CHOL）培養(yǎng)基的配制

準確稱取膽固醇1g，以無水乙醇定容至100mL，即可獲得10mg/mL的膽固醇溶液，使用前用0.45μm濾膜過濾。在滅菌過的MRS液體培養(yǎng)基中添加1%上述溶液，使膽固醇終濃度為100μg/mL。

1.2.2 膽固醇降低曲線及方式的測定 將活化后的la1和la2以體積分數(shù)為4%的接種量接種于含有0.1%牛膽鹽的MRS－CHOL培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃下培養(yǎng)，每隔4h取1次樣，于4℃6 000r/min下離心15min測其上清液膽固醇含量，沉淀用同體積的pH 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌兩遍，同樣條件離心，得到的上清液為沉淀洗滌液用于膽固醇測定。

1.2.3 接種量對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響 將活化后的la1和la2分別以1%，2%，3%，4%，5%的接種量接種于牛膽鹽含量為0.1%的 MRS－CHOL液體培養(yǎng)夜內(nèi)，37℃ 條件下培養(yǎng)24h后，于4℃6 000r/min下離心15min測其上清液膽固醇含量，計算其膽固醇降低率。

1.2.4 膽鹽種類對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響

將活化后的la1和la2以4%的接種量分別接種于含膽鹽量為0.1%的膽酸、牛磺膽酸鈉、牛膽鹽 MRS－CHOL液體培養(yǎng)液中，37℃條件下培養(yǎng)24h后，于4℃6 000r/min下離心15min測其上清液膽固醇含量，計算其膽固醇降低率。

1.2.5 膽鹽添加量對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響

將活化后的la1和la2以4%的接種量分別接種于含牛膽鹽為 0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5% （m/V）的MRS－CHOL培養(yǎng)液內(nèi)，37℃條件下培養(yǎng)24h后，于4℃6 000r/min下離心15min測其上清液膽固醇含量，計算其膽固醇降低率。

1.2.6 吐溫80添加量對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響 將活化后的la1和la2以4%的接種量接種于牛膽鹽含量為0.1%，吐溫80含量分別為0.05%，0.10%，0.15%，0.20% 的 MRS－CHOL液體培養(yǎng)液中，37℃ 條件下培養(yǎng)24h后，于4℃6 000r/min下離心15min測其上清液膽固醇含量，計算其膽固醇降低率。

2 結(jié)果與討論

2.1 膽固醇降低曲線及方式的測定

Liong M T等［5］認為膽固醇的去除與菌體的生長有密切關(guān)系。而本試驗得到了相似的結(jié)果，見圖1。

圖1 la1和la2的膽固醇降低曲線Figure 1 The removal curve of cholesterol by la1and la2

在la1和la2培養(yǎng)的初期（0～8h），細菌正處于生長的延滯留期，菌體生長緩慢，而且菌體數(shù)量也相對較低，因此膽固醇降低率也低，但隨著培養(yǎng)時間的延長（8～24h），菌體生長活躍，活菌數(shù)急速增加，菌體進入了對數(shù)生長期，細菌上清液中的膽固醇含量急劇下降，在24h附近達到了最大值，la1和la2對膽固醇的降低率分別達到了53.11%和42.92%。而在培養(yǎng)的末期（24～32h），膽固醇降低率略有下降，這可能是由于在菌體生長的后期，一部分菌體死亡后，菌體裂解將膽固醇釋放出來的結(jié)果［6］。

為了進一步考察la1和la2對膽固醇的降低方式，對培養(yǎng)24h的菌體用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液進行洗滌，得到了沉淀洗滌液，作為其與膽固醇的共沉淀率，同化率為膽固醇降低率與共沉淀率之差，結(jié)果見圖2。

圖2 la1和la2的降膽固醇方式Figure 2 The removal ways of cholesterol by la1and la2

由圖2可知，la1和la2對膽固醇的同化率要明顯高于共沉淀率，其中同化率分別為42.13%和37.05%，而共沉淀率僅為10.59%和5.37%。因此，la1和la2對膽固醇的降低作用是以同化為主的多方面共同作用的結(jié)果。

2.2 接種量對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響

菌種接種量對發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)有重要的影響，特別是發(fā)酵乳類產(chǎn)品，考慮到菌株的應(yīng)用及對發(fā)酵產(chǎn)品pH值的要求，一般接種量為1%～5%［7］。

由圖3可知，隨著接種量的增加，兩株菌對膽固醇的降低率也隨之增大；但接種量超過3%時，其增速放緩，當接種量達到5%接種量時解率都達到各自最高值，la1降低率高達58.63%，而la2也達到了47.97%。對于各菌株而言，在不同接種量條件下，la1菌株的降低率一直保持最高。

圖3 接種量對la1和la2降膽固醇的影響Figure 3 The influence of different inoculation amounts on the cholesterol－reducing by la1and la2

2.3 膽鹽種類對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響

Klaver等［8］提出細菌從培養(yǎng)基中去除膽固醇是游離膽酸和膽固醇在pH低于5.5時共同沉淀的結(jié)果，乳酸菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶（BSH），通過水解結(jié)合型膽鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x膽酸，因后者的溶解度降低與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用。因此，培養(yǎng)基中的膽鹽存在與否，膽鹽的結(jié)合狀態(tài)都會影響乳酸菌的降膽固醇作用。試驗選用3種不同類型的膽鹽來研究膽鹽對la1和la2降膽固醇作用的影響。

圖4 la1和la2在不同膽鹽培養(yǎng)基中的降膽固醇能力Figure 4 Cholesterol removal in different bile salts by la1and la2

由圖4可知，la1和la2在同一膽鹽培養(yǎng)基內(nèi)的降膽固醇能力不同，并且同一菌株在不同膽鹽存在下，表現(xiàn)的降膽固醇能力也是不同的，但無論在哪種膽鹽下，la1對膽固醇的降低能力都要高于la2。la1和la2對脫結(jié)合型膽鹽－游離膽酸培養(yǎng)基的降膽固醇作用最強，分別為56.54%和48.24%；其次為混合型膽鹽－牛膽鹽，降低率為52.18%和43.12%；純結(jié)合型膽鹽－牛磺膽酸鈉最低，但也達到了38.19%和34.37%。由于膽固醇只能在pH低于5.5時與脫結(jié)合型的膽鹽發(fā)生共沉淀作用，因此，從兩株菌在牛磺膽酸鈉培養(yǎng)基內(nèi)對膽固醇的降低能力也側(cè)面反映了其產(chǎn)膽鹽水解酶（BSH）的能力。

2.4 膽鹽添加量對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響

由圖5可知，在沒有膽鹽的存在下，la1和la2對膽固醇也有較好的降低作用，膽固醇降低率分別為40.37%和36.85%。當培養(yǎng)基內(nèi)添加不同含量的膽鹽后，菌株對膽固醇的降低能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在膽鹽添加量為2%時，膽固醇降低率達到最大，分別為54.28%和43.35%，而后，隨著膽鹽濃度增加，降膽固醇作用逐漸降低。這可能是適當濃度的膽鹽不但可以與膽固醇發(fā)生共沉淀作用，而且還能增加細胞膜通透性利于膽固醇的同化作用［9］，然而隨著膽鹽濃度的提高，抑制了菌體的生長，導(dǎo)致其降膽固醇作用的下降。

圖5 膽鹽添加量對la1和la2降膽固醇的影響Figure 5 The influence of theaddition of bile salt on cholesterol－reducing by la1and la2

2.5 吐溫80添加量對嗜酸乳桿菌降低膽固醇作用的影響

吐溫80既是一種乳化劑，又是乳酸菌的生長刺激因子，對乳酸菌的生長有非常重要的作用。在培養(yǎng)基內(nèi)添加不同濃度的吐溫80，其結(jié)果見圖6。

圖6 吐溫80添加量對la1和la2降膽固醇的影響Figure 6 The influence of different dosages of tween80 on cholesterol removal by la1and la2

由圖6可知，吐溫80含量低于0.1%時，la1和la2對膽固醇的降低作用呈上升趨勢，當含量為0.1%時，降低率達到最大值，分別為52.36%和44.19%，當含量超過0.1%后，隨著含量的增加降低率呈現(xiàn)下降趨勢。其原因可能是，在低濃度時，吐溫80可以刺激菌株的生長，同時對培養(yǎng)基內(nèi)膽固醇進行乳化作用，使膽固醇可以均勻的分散于培養(yǎng)基內(nèi)，增大了與菌體的接觸面積，更有利于對膽固醇的同化吸收；但是過高的吐溫80含量又會被菌體代謝利用，作為細胞膜脂質(zhì)的組成成分，進而改變細胞膜的特性（彈性、流動性、柔韌性等），使細胞膜的通透性降低［10，11］，進而影響了菌體對膽固醇的同化吸收作用。

3 結(jié)論

通過本試驗可知，嗜酸乳桿菌la1和la2對膽固醇均有良好的降低作用，但la1的降低率（53.11%）要明顯高于la2（42.92%）。在培養(yǎng)過程中，嗜酸乳桿菌la1和la2對膽固醇的降低率受培養(yǎng)時間、菌種接種量、膽鹽種類及添加量、吐溫80添加量等多種因素的影響。此外，在試驗中還發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌la1和la2對膽固醇的降低作用是以同化方式為主的多方面的結(jié)果，但是對同化作用的具體的過程及是否存在某種關(guān)鍵物質(zhì)等問題還不是很清楚，還需要進一步的深入研究。雖然嗜酸乳桿菌體外與體內(nèi)降低膽固醇的方式有很大不同，但是通過對其體外降低膽固醇作用的研究，可以為嗜酸乳桿菌保健食品的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 任邦哲，蔣中俊.生物化學與臨床醫(yī)學［M］.長沙：湖南科學技術(shù)出版社，1993：202～206.

2 劉娟.植物乳桿菌ST－Ⅲ菌株降膽固醇機理的研究［D］.上海：上海海洋大學，2008.

3 Ooi L G and Liong M T .Cholesterol－lowering effects of probiotics and prebiotics：a review of in vivo and in vitro findings［J］.Int.J.Mol.Sci.，2010，11（6）：2 499～2 522.

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5 Liong M T，Shah N P.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains［J］.J.Dairy Sci.，2005，88：55～66.

6 趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究［M］.北京：科學出版社，2007：72～74.

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8 Klaver E A K，Van Der Meer R.The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt deconjugation activity［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59：1 120～1 124.

9 張旻.降膽固醇功能乳桿菌的篩選及降解機理研究［D］.上海：上海交通大學，2006.

10 閆學會，張?zhí)m威，馮鎮(zhèn)，等.吐溫80對液氮冷凍處理的雙歧桿菌的凍傷保護［J］.食品工業(yè)科技，2006，27（9）：75～80.

11 Noh D O，Kim S H，Gilliland S E.Incorporation of cholesterol into the cellular membrane ofLactobacillus acidophilusATCC 43121［J］.J.Dairy Sci.，1997，81（7）：1 818～1 824.

Study on cholesterol removal by twoLacto b acillus acidophilusstrains

LU Si－h(huán)ai ZHAO Rui－xiangQI Ting－ting

（Food College，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan453003，China）

The removal curve and ways of cholesterol of twoLactobacillus acidophilusstrains were investigated，and the effect of different culture conditions on cholesterol reduced by two strains were also studied in vitro.Both of two strains showed a significant ability to reduce cholesterol，which was due to both bacterial assimilation and precipitation of cholesterol，mainly bacterial assimilation；as inoculation amount increased，the reduction rate increased；the effect of various bile salts on cholesterol reduction were different，the maximum amount of cholesterol reduction could be reached when the addition of bile salt was 0.2% （m/V）；the effect of cholesterol reduction was best when the dosage of 0.1%tween 80.

Lactobacillus acidophilus；cholesterol；reduction rate

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.014

路四海（1985－），男，河南科技學院在讀碩士研究生。E－mail：lusihai123＠126.com

2011－08－01