地被菊直接體細(xì)胞胚發(fā)生的優(yōu)化

蔣 凡，黃壽先，張皓磊，蔣細(xì)旺

（1.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧530004；2.江漢大學(xué) 生命科學(xué)院，湖北 武漢430056）

1 引言

體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)主要有兩種途徑：一是直接由葉片的葉脈及脈間表皮細(xì)胞分裂產(chǎn)生（直接類型）：二是首先由莖段脫分化成愈傷組織，然后由這些愈傷組織的某些細(xì)胞形成體細(xì)胞胚（間接類型）［1］。由葉片的表皮細(xì)胞分裂產(chǎn)生體細(xì)胞胚，取材容易，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的速度快。

直接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑形成的體胚，發(fā)生頻率高，無(wú)畸形胚產(chǎn)生，生長(zhǎng)健壯，分化能力強(qiáng)，成苗率高，而且直接體細(xì)胞胚的再生植株變異頻率低［2］。直接體細(xì)胞胚具有很強(qiáng)的接受外源DNA的能力，是理想的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；而且胚性細(xì)胞繁殖量大，同步性好，轉(zhuǎn)化后的胚性細(xì)胞可順利發(fā)育成胚狀體及完整的轉(zhuǎn)基因植株。大量研究表明，直接體細(xì)胞胚發(fā)生多是單細(xì)胞起源，轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少［3，4］，因此，植物通過(guò)直接體細(xì)胞胚發(fā)生形成的體細(xì)胞胚可作為理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體體系［5，6］。

蔣細(xì)旺等［7］在對(duì)地被菊“玉人面”直接體細(xì)胞胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，葉片經(jīng)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L）誘導(dǎo)10 d后，發(fā)現(xiàn)有薄層愈傷的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)接到體細(xì)胞胚發(fā)育培養(yǎng)基（MS＋KT 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L）中，13d后，發(fā)現(xiàn)有大量淡黃色顆粒突起，同時(shí)愈傷量會(huì)增多，到15d時(shí)發(fā)現(xiàn)有大量芽點(diǎn)出現(xiàn)，到17d時(shí)發(fā)現(xiàn)有大量芽出現(xiàn)，到24d時(shí)，又有一批球狀顆粒突起，到30d時(shí)，能顯著觀察到分化出兩批植株，高度相差約5mm，高度比值約3～4倍。這兩批植株的出現(xiàn)時(shí)間相差大約7～10d。而且由上述誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚再生出的苗容易玻璃化，體細(xì)胞胚發(fā)育為芽之前，葉片外植體表面上容易生根，由體細(xì)胞胚發(fā)生途徑轉(zhuǎn)化為器官發(fā)生途徑；薄層愈傷的出現(xiàn)，也會(huì)有一部分體細(xì)胞胚是間接體細(xì)胞胚發(fā)生。

由于3種方式發(fā)生的時(shí)間不一致，在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，農(nóng)桿菌侵染的最佳時(shí)間也會(huì)有差異，而使轉(zhuǎn)化效率低下。目前對(duì)地被菊直接體細(xì)胞胚發(fā)生中出現(xiàn)器官發(fā)生途徑及間接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑該如何克服的研究較少。達(dá)克東［8］在蘋果離體葉片培養(yǎng)誘導(dǎo)直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)，2，4－D是使外植體產(chǎn)生薄層愈傷組織的原因之一，葉片在含有2，4－D的培養(yǎng)基中處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)是使外植體產(chǎn)生愈傷組織的原因之二，通過(guò)縮短胚性細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間和減少誘導(dǎo)培養(yǎng)基中蔗糖量來(lái)減少葉片直接體細(xì)胞胚發(fā)生中的間接體細(xì)胞胚發(fā)生的百分率來(lái)得到優(yōu)化。而張健［9］通過(guò)提高誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度到（5%～10%），來(lái)提高柑桔幼胚的直接體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率來(lái)得到優(yōu)化。馬國(guó)華［10］在木薯嫩葉直接誘導(dǎo)初生體細(xì)胞胚胎發(fā)生和芽的形成的研究中，發(fā)現(xiàn)NAA不僅能夠誘導(dǎo)木薯嫩葉產(chǎn)生體細(xì)胞胚，而且能夠直接誘導(dǎo)芽的形成，其它幾種生長(zhǎng)素類化合物如2，4－D、dicamba或picloram等只能直接誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，所不同的是這種NAA誘導(dǎo)的木薯體細(xì)胞胚胎發(fā)生和芽的器官發(fā)生幾乎是同步進(jìn)行的，但它們之間在形態(tài)上和植株再生的時(shí)間及方式上存在較大的差異。

2 材料與方法

“玉人面”‘Yurenmian’（白花）由北京林業(yè)大學(xué)陳俊愉院士提供。MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，試驗(yàn)激素分別為2，4－D（2，4二氯苯氧乙酸）、KT（激動(dòng)素）、NAA（萘乙酸）。

2.1 無(wú)菌苗的獲得和葉片外植體的準(zhǔn)備

按蔣細(xì)旺等［11］的方法和培養(yǎng)條件獲得無(wú)菌苗并繼代。從新增殖（4周左右）的幼苗上切取嫩葉，并去除葉緣切成約0.5cm2的葉片，以近軸面接觸培養(yǎng)基。每培養(yǎng)皿接種25個(gè)外植體，重復(fù)5次。

2.2 玉人面的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的影響

按蔣細(xì)旺等［7］的方法和培養(yǎng)條件，進(jìn)行體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)，即在誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L中，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)3d、5d、7d、10d和15d，然后轉(zhuǎn)入 MS＋KT2.0mg／L＋NAA0.5mg／L中培養(yǎng)。蔗糖濃度為30g／L，瓊脂糖濃度為6g／L，pH 值為6.0，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，日光燈光源，光照（2 000lx）12h·－1。一共培養(yǎng)25d后，計(jì)算直接體細(xì)胞胚發(fā)生率、平均每外植體分化的體細(xì)胞胚數(shù)、體細(xì)胞胚發(fā)育為芽前的生根率及玻璃化率。

2.3 不同蔗糖濃度對(duì)玉人面體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

外植體先在 MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L中培養(yǎng)5d，其中蔗糖濃度分別為10g／L、30g／L和60g／L；然后分別轉(zhuǎn)入含10g／L、30g／L、60g／L蔗糖的 MS＋KT 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一共培養(yǎng)25d后，計(jì)算直接體細(xì)胞胚發(fā)生率、平均每外植體分化的體細(xì)胞胚數(shù)、體細(xì)胞胚發(fā)育為芽前的生根率及玻璃化率。

2.4 激素對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響

外植體先培養(yǎng)在 MS＋KT 2.0mg／L＋2，4－D 2.0mg／L＋NAA 0.5mg／L中，蔗糖濃度為10g／L，誘導(dǎo)5d后；轉(zhuǎn)入MS＋KT＋NAA，其中的KT濃度為（0、0.5、1.0、2.0、4.0mg／L），NAA 濃度為（0、0.5mg／L），共20個(gè)組合，蔗糖濃度為30g／L。共計(jì)培養(yǎng)25d后，計(jì)算直接體細(xì)胞胚發(fā)生率、平均每外植體分化的體細(xì)胞胚數(shù)和體細(xì)胞胚發(fā)育為芽前的生根率。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行方差分析與多重比較（LSD法，P＝0.05）。

（1）體細(xì)胞胚發(fā)生率（%）＝產(chǎn)生體細(xì)胞胚的外植體個(gè)數(shù)／外植體總數(shù)×100%。

（2）平均每外植體體細(xì)胞胚發(fā)生個(gè)數(shù)＝所有外植體產(chǎn)生的體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)／外植體總數(shù)×100%。

（3）體細(xì)胞胚發(fā)育為芽前的生根率＝外植體生根的個(gè)數(shù)／外植體總數(shù)×100%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉人面體細(xì)胞胚發(fā)生的研究

體細(xì)胞胚發(fā)生率在誘導(dǎo)培養(yǎng)7d時(shí)最高，達(dá)100%，誘導(dǎo)培養(yǎng)超過(guò)7d或少于7d體細(xì)胞胚發(fā)生率都會(huì)稍降低；每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量在10d達(dá)到12.3個(gè)，誘導(dǎo)培養(yǎng)超過(guò)10d或少于10d每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量不同程度的減少；僅誘導(dǎo)培養(yǎng)3d時(shí)體細(xì)胞胚發(fā)育為芽前，沒(méi)有有根的生成，其它誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間有不同程度的生根；薄層愈傷量在各個(gè)培養(yǎng)時(shí)間均有，但程度不同。可見(jiàn)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生率、每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量、生根率、薄層愈傷量影響均較大（表1）。最終篩選出7d為最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間，見(jiàn)圖1。

表1 玉人面的誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的研究

圖1 經(jīng)過(guò)7d誘導(dǎo)培養(yǎng)的玉人面體細(xì)胞

3.2 不同蔗糖濃度對(duì)玉人面體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及發(fā)生的調(diào)控研究

直接體細(xì)胞胚誘導(dǎo)階段，若培養(yǎng)基的蔗糖濃度過(guò)高，經(jīng)誘導(dǎo)后，易出現(xiàn)薄層愈傷，產(chǎn)生間接體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚萌發(fā)獲得的苗易玻璃化；直接體細(xì)胞胚發(fā)生階段，若培養(yǎng)基的蔗糖濃度過(guò)高，獲得的苗容易黃化。若直接體細(xì)胞胚一直用高濃度的蔗糖，愈傷程度很大，獲得的苗極度畸形，大部分是通過(guò)間接體細(xì)胞胚獲得的苗。若一直用低濃度的蔗糖，體細(xì)胞胚發(fā)生率及每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量很低。可見(jiàn)蔗糖濃度的變化對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生率、每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量、生根率、薄層愈傷量影響也較大（見(jiàn)表2）。優(yōu)化結(jié)果：直接體細(xì)胞胚誘導(dǎo)階段用10g／L的蔗糖，體細(xì)胞胚發(fā)育階段用30g／L的蔗糖，見(jiàn)圖2。

表2 不同蔗糖濃度對(duì)玉人面體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及發(fā)生的調(diào)控研究

圖2 用蔗糖濃液誘導(dǎo)培養(yǎng)的玉人面體細(xì)胞

3.3 激素濃度對(duì)玉人面體細(xì)胞胚發(fā)生的研究

對(duì)于加了NAA的培養(yǎng)基，體細(xì)胞胚發(fā)生率、每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量及生根率均比沒(méi)加NAA的培養(yǎng)基的要高。但加了NAA后，在體細(xì)胞胚發(fā)育成植株前易生根，容易走器官發(fā)生途徑。所以在地被菊“玉人面”體細(xì)胞胚發(fā)生途徑中，應(yīng)去掉NAA，在體細(xì)胞胚發(fā)生前就不會(huì)有根的形成，培養(yǎng)25后，待芽長(zhǎng)出后，才有根的形成。在沒(méi)加NAA的五種培養(yǎng)基中，KT為2.0時(shí)，體細(xì)胞胚發(fā)生率及每個(gè)外植體體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量均最高。優(yōu)化后的結(jié)果：直接體細(xì)胞胚發(fā)育培養(yǎng)基應(yīng)去掉NAA，僅用2.0mg／L的KT的培養(yǎng)基，見(jiàn)圖3。

表3 激素濃度對(duì)玉人面體細(xì)胞胚發(fā)生的研究

圖3 用激素濃液誘導(dǎo)培養(yǎng)的玉人面體細(xì)胞

4 結(jié)語(yǔ)

本文研究得到，地被菊“玉人面”的直接體細(xì)胞胚誘導(dǎo)最佳時(shí)間為7d，誘導(dǎo)7d后轉(zhuǎn)入去除2，4－D的培養(yǎng)基中進(jìn)行體細(xì)胞胚的發(fā)育。崔凱榮［12］等研究發(fā)現(xiàn)體胚誘導(dǎo)后必須去掉2，4－D。2，4－D的作用具有階段性，在誘導(dǎo)階段通常起促進(jìn)作用，而在胚狀體分化發(fā)育階段一般起抑制作用。周俊彥［13］等研究也發(fā)現(xiàn)2，4－D對(duì)胡蘿卜的體胚前期誘導(dǎo)有利，對(duì)后期發(fā)育抑制。2，4－D的階段性抑制作用，目前可從三個(gè)水平上得到證實(shí)。在生理水平上，Tisserat B［14］等認(rèn)為2，4－D 可能通過(guò)促進(jìn)乙烯合成而抑制體胚發(fā)育。這種抑制體胚發(fā)育已為胡蘿卜、枸杞、三葉草，芹菜等許多植物體胚發(fā)生所證實(shí)［15－16］。在分子水平上，韓碧文［17］等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2，4－D通過(guò)抑制胚胎發(fā)育基因的程序表達(dá)來(lái)抑制體細(xì)胞胚的后期發(fā)育。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)水平上，崔凱榮［18］等認(rèn)為2，4－D是先與細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白（ABP）作用，然后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)，激活某些基因的表達(dá)，產(chǎn)生特異的mRNA，而促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生；但是，一段時(shí)間后，它又可以抑制這些基因的表達(dá)，激活另一些基因的表達(dá)，從而防礙體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育，認(rèn)為2，4－D對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控有時(shí)空特異性。本文的研究結(jié)果認(rèn)為，誘導(dǎo)時(shí)間低于7d可能是誘導(dǎo)時(shí)間不夠，直接體細(xì)胞胚發(fā)生相關(guān)基因沒(méi)有充分誘導(dǎo)表達(dá)，而使直接體細(xì)胞胚發(fā)生率和每個(gè)外植體上直接體細(xì)胞胚發(fā)生的數(shù)量較低；誘導(dǎo)時(shí)間多于7d，在2，4－D的培養(yǎng)基中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抑制了直接體細(xì)胞胚發(fā)育相關(guān)基因的程序表達(dá)來(lái)抑制體細(xì)胞胚的后期發(fā)育，進(jìn)而使直接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑轉(zhuǎn)向間接體細(xì)胞胚發(fā)生途徑，導(dǎo)致產(chǎn)生薄層愈傷。

蔗糖量的增加會(huì)引起外植體愈傷組織量的增加和間接類型體細(xì)胞胚發(fā)生，適當(dāng)減少培養(yǎng)基中蔗糖量有利于葉片直接體細(xì)胞胚誘導(dǎo)；在直接體細(xì)胞胚發(fā)育的過(guò)程中，提高蔗糖濃度，抑制體胚迅速發(fā)育為植株和大量根的生成，促進(jìn)胚胎的發(fā)育并停留在球形胚期，調(diào)控胚胎發(fā)育。培養(yǎng)基中的糖除了提供培養(yǎng)物的碳源以外還起著調(diào)節(jié)滲透壓的作用，一般在體胚誘導(dǎo)階段需要較低的蔗糖濃度［19］，而在體胚成熟階段則需要較高的蔗糖濃度［20］。分子水平上，蔗糖如何調(diào)控胚胎的發(fā)育，程玉蘭［21］等認(rèn)為在體胚發(fā)育過(guò)程中，蔗糖濃度可導(dǎo)致體胚內(nèi)源ABA水平的變化，表現(xiàn)為：60S，ABA含量稍微有下降，并趨于穩(wěn)定，胚也逐漸進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)，并停留在晚期子葉胚后，不再繼續(xù)發(fā)育，而在胚根處產(chǎn)生大量的次生胚；對(duì)30S，ABA含量緩慢下降，并開始初生根的發(fā)育，但初生根的發(fā)育緩慢；在10S中，其內(nèi)源ABA含量急劇下降，胚的形態(tài)建成后就迅速開始胚后發(fā)育，子葉胚迅速長(zhǎng)成小苗，根長(zhǎng)度伸長(zhǎng)至胚體的幾倍。顯然：在體胚發(fā)育過(guò)程中，高濃度的ABA水平有利于胚性狀態(tài)的維持。本研究也觀察到這一現(xiàn)象。進(jìn)一步有學(xué)者研究，刑更生［22］等認(rèn)為ABA通常對(duì)DNA和RNA的合成有抑制作用，但對(duì)某些植物體細(xì)胞胚發(fā)生的特異基因表達(dá)則起調(diào)控作用，抑制體細(xì)胞胚過(guò)早萌發(fā)。但這種分子調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步研究。

本研究在體細(xì)胞胚發(fā)育階段去掉NAA后，在體細(xì)胞胚發(fā)育成植株前沒(méi)有根的生成。有理由認(rèn)為：NAA不僅能夠誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生體細(xì)胞胚，而且能夠直接誘導(dǎo)芽的形成。這和馬國(guó)華［10］的研究結(jié)果相同。

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