Snail mRNA在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

熊正文,李永申,李 偉,李宏偉,黃 勇,張華東,尋鳳華

上皮 -間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)過程,在胚胎發(fā)育早期較為多見,也存在于多種慢性疾病以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,它以上皮細(xì)胞極性喪失及其間質(zhì)特性的獲得為主要特征[1]。EMT在腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[2],研究表明轉(zhuǎn)錄因子 Snail可促使 EMT的發(fā)生[3],其在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)[4]。本研究采用原位分子雜交技術(shù)分別檢測 Snail mRNA在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺單純性增生組織中的表達(dá),旨在探討其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集經(jīng)臨床病理醫(yī)生診斷為乳腺單純增生、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌的組織標(biāo)本各 30例,乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本 70例。70例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中腫瘤直徑 ＜2 cm者 9例,≥2 cm者 61例;局部腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者 21例,陽性者49例。根據(jù) WHO的組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級 15例,Ⅱ級 35例,Ⅲ級 20例。標(biāo)本均來自中國人民解放軍 251醫(yī)院病理科2008—2009年存檔的資料,患者年齡 22～75歲,平均 47歲,術(shù)前均未接受化療、激素治療及放療。組織標(biāo)本經(jīng) 10%甲醛溶液常規(guī)固定,石蠟包埋,連續(xù)切片 4μm,裱于經(jīng) APES處理的載玻片上,65℃烤箱烤片過夜,防止脫片。

1.2 試劑及其來源 Snail原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司 (MK2640-h),探針為針對人 Snail靶基因的 mRNA序列 (5'-AGAGTTTACCTTCCAGCAGCCCTACGACCAGGCCC-3';5'-AAGGCCTTCAACTGCAAATACTGCAA-CAAGGAATA-3';5'-TACCAGTGCCAGGCGTGTGCTCGGACCTTCTCCCG-3'),顯示系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素 (SABC-POD),DAB顯色。

1.3 原位雜交 石蠟切片復(fù)溫,脫蠟至水。3%H2O2室溫下作用 10 min,蒸餾水洗 3次,3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶室溫下消化 30 min。1%的多聚甲醛室溫下固定 10 min,蒸餾水洗3次,每張切片滴加 20μl預(yù)雜交液,置濕盒中放入 40℃恒溫箱 4 h。滴加雜交液 20μl/片,置 38～42℃恒溫箱中過夜。37℃預(yù)溫的 2×SSC沖洗 5 min×3次,37℃預(yù)溫的 0.5×SSC沖洗 5 min×3次,37℃預(yù)溫的 0.2×SSC沖洗 5 min×3次。滴加封閉液,37℃30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60 min。滴加 SABC,37℃20 min。滴加生物素過氧化物酶,37℃20 min。DAB避光顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片,每批染色均用已知陽性切片作為陽性對照,用 PBS代替雜交液作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 Snail mRNA原位分子雜交陽性信號為棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。每張切片選擇 10個高倍視野,按陽性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為:無陽性著色或陽性細(xì)胞數(shù) ＜10%為陰性,陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性[5]。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理,采用χ2檢驗,以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail mRNA在不同乳腺組織中的表達(dá) Snail mRNA原位分子雜交陽性信號為棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。70例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Snail mRNA陽性率為 81.4%(57/70),30例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中 Snail mRNA陽性率為 46.7%(14/30),30例乳腺單純性增生組織中 Snail mRNA陽性率為23.3%(7/30),三者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=32.4,p＜0.01)。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中 Snail mRNA陽性率分別高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織和乳腺單純性增生組織中的陽性率,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2值分別為 12.3和 30.8,p＜0.01)。Snail mRNA的表達(dá)水平隨著乳腺單純性增生、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌變化而呈現(xiàn)增高的趨勢 (見圖 1～4)。

圖 1 乳腺單純性增生組織中 Snail mRNA陽性表達(dá) (ISH法, ×200)Figur e 1 The positive expression of Snail mRNA in simplex breast hyperplasia

圖 2 乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中 Snail mRNA陽性表達(dá) (ISH法, ×200)Figur e 2 The positive expression of Snail mRNA in intraductal breast cancer

圖 3 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織 Snail mRNA弱陽性表達(dá) (ISH法, ×100)Figur e 3 The poor positive expression of Snail mRNA in invasive ductal breast cancer

圖 4 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織 Snail mRNA強陽性表達(dá) (ISH法,×200)Figur e 4 The strong positive expression of Snail mRNA in invasive ductal breast cancer

2.2 Snail mRNA的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比,Snail mRNA陽性率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.004);而不同年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級者的 Snail mRNA陽性率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05,見表 1)。

表 1 Snail mRNA表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 The relationship between the expression of Snail mRNA and clinicopathologic feature

3 討論

3.1 Snail mRNA在不同乳腺疾病中的表達(dá)情況 Snail基因定位于人類染色體20q13.13,Snail/Slug都屬于鋅指蛋白 Snail超家族,它們通過與 Smad相互作用蛋白 (Smad-interacting protein-1,SIP1)競爭性結(jié)合 E-cadherin啟動子區(qū)的 E-box序列,抑制 E-cadherin、occludin等的表達(dá),上調(diào) FSP1、vimentin和 Rho等的表達(dá),從而誘導(dǎo) EMT的發(fā)生,提高細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,所以 Snail可以被看作腫瘤轉(zhuǎn)移的促進因素[6]。本研究結(jié)果顯示,隨著病變程度加重,Snail mRNA的陽性率明顯增高,這提示 Snail mRNA的高表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著十分重要的作用,這與 Lee等[7]對宮頸癌的研究結(jié)果基本一致。

3.2 Snail mRNA在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 近年 Snail在 EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來越受到人們的關(guān)注,Snail mRNA在多種腫瘤中均有表達(dá),此外,對人類腫瘤標(biāo)本進行免疫組化檢測表明,Snail蛋白高表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、食管癌等,并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級密切相關(guān)[8]。吳繼鋒等[9]采用原位分子雜交技術(shù)檢測胃癌組織及癌旁組織 Snail mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示Snail mRNA表達(dá)與胃癌的組織分化、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),而與患者的年齡、性別、腫瘤大小均無關(guān)。Come等[10]研究發(fā)現(xiàn) Snail主要表達(dá)于乳腺癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),相應(yīng)正常組織往往缺如,且與乳腺癌的組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān),細(xì)胞核中 Snail的表達(dá)與乳腺癌的高級別和增殖活性有關(guān),但與腫瘤復(fù)發(fā)無關(guān)。Lundgren等[11]通過體外研究發(fā)現(xiàn),Snail蛋白的過表達(dá)能夠增強乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7、T-47D和 MDA-MB-468的移動性,而不表達(dá) Snail蛋白的細(xì)胞株 MFC-7、MDA-MB-468和 MDA-MB-231的移動性則降低。本研究發(fā)現(xiàn) 70例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Snail mRNA陽性率為 81.4%,其中Ⅲ級者較Ⅰ、Ⅱ級者,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 Snail mRNA的陽性率均明顯增高,但 Snail mRNA陽性率與患者的性別和腫瘤大小均無關(guān),這與文獻(xiàn)報道的基本一致[8-11]。Snail mRNA在高級別、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中,其陽性表達(dá)率均明顯增強,提示 Snail mRNA在腫瘤中的表達(dá)越高,癌細(xì)胞的生存能力和腫瘤的惡性程度可能也隨之增高,癌細(xì)胞更容易侵襲周圍組織并發(fā)生轉(zhuǎn)移,即 Snail mRNA的高表達(dá)可能預(yù)示預(yù)后不良。

3.3 Snail與 EMT EMT是指在某些特殊的生理或病理條件下,具有極性的上皮細(xì)胞失去極性,轉(zhuǎn)換成具有活動能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動的間質(zhì)細(xì)胞的過程[12]。在 EMT過程中,細(xì)胞的功能發(fā)生了變化,與相鄰的細(xì)胞分離,遷移到鄰近的組織,其主要分子特征如 E-鈣黏素、角蛋白等上皮標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)和 N-鈣黏素、波形蛋白等間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)[13]。有研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子 Snail通過與上皮鈣黏附分子 E-cadherin啟動子區(qū)結(jié)合而轉(zhuǎn)錄抑制 E-cadherin的表達(dá),從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。本研究結(jié)果表明,Snail mRNA在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)顯著高于在乳腺單純性增生和乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá),提示 Snail mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)是一個漸進的過程,隨著癌前細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,Snail mRNA的表達(dá)逐漸增高,這說明了 Snail可能促進了乳腺正常上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)變,提高了乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能,從而為乳腺癌轉(zhuǎn)移分子機制提供了理論證據(jù),并為其靶向逆轉(zhuǎn)提供了參考靶點。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程受多種因素的影響,是多種基因相互協(xié)調(diào)、相互作用的結(jié)果。EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移之間存在著復(fù)雜的調(diào)控機制,不僅與 Snail的表達(dá)有關(guān),可能還與其他許多信號分子表達(dá)有關(guān),有待進一步深入研究。

綜上所述,Snail mRNA在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織的表達(dá)高于乳腺單純性增生和乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織的表達(dá),可能對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移起到促進作用。研究證實拮抗 Snail的作用可使癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移的潛能下降[15]。推測 Snail可能作為轉(zhuǎn)錄因子,居于信號通路級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),對其上游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及下游 Snail轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因進行調(diào)控,通過阻斷Snail信號途徑,進而采取針對 Snail的干預(yù)方案,有望降低乳腺癌的惡性程度及浸潤轉(zhuǎn)移率,從而改善患者的預(yù)后。同時Snail還有可能作為腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志物,這將會促進腫瘤治療新方案的研究,對提高患者的生存率起積極作用。

1 Mathias RA,Simpson RJ.Towards understanding epithelial-mesenchymal transition:a proteomicsperspective[J].Biochim Biophys Acta,2009,1794(9):1325-1331.

2 Voulgari A,Pintzas A.Epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis:Mechanisms,markers and strategies to overcomedrugresistance in the clinic[J].Biochim Biophys Acta,2009,1796(2):75-90.

3 Kokudo T,Suzuki Y,Yoshimatsu Y,et al.Snail is required for TGF-βinduced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells[J].J Cell Sci,2008,121(Pt20):3317-3324.

4 Becker KF,Rosivatz E,Blechschmidt K,et al.Analysis of the E-cadherin repressor Snail in primary human cancers[J].Cells Tissues Organs,2007,185(1-3):204-212.

5 Sugimachi K,Tanaka S,Kameyama T,et al.Transcriptional repressor Snail and progression of human hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2003,9(7):2657-2664.

6 Evdokimova V,Tongon C,Ng T,et al.Translational activation of Snail 1and other developmentally regulated transcription factors by YB-1 promotes an epithelial-mesenchymal transition[J].Cancer Cell,2009,15(5):402-415.

7 Lee MY,Chou CY,Tang MJ,et al.Epithelial-mesenchymal transition in cervical cancer:correlation with tumor progression,epidermal growth factor receptor overexpression,and Snail up-regulation[J].Clin Cancer Res,2008,14(15):4743-4750.

8 Natsugoe S,Uchikado Y,Okumura H,et al.Snail plays a key role in E-cadherin-preserved esophageal squamous cell carcinoma[J].Omol Rep,2007,17(3):517-523.

9 吳繼鋒,馬偉,張紅,等 .Snail基因及其蛋白、E-cadherin蛋白在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義 [J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2009,18(2):167-173.

10 C?me C,Magnino F,Bibeau F,et al.Snail and slug play distinct roles during breast carcinoma progression[J].Clin Cancer Res,2006,12(18):5395-5402.

11 Lundgren K,Nordenskj?ld B,Landberg G.Hypoxia,Snail and incomplete epithelialmesenchymal transition in breast cancer[J].Br J Cancer,2009,101(10):1769-1781.

12 Kalluri R,Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J].J Clin Invest,2009,119(6):1420-1428.

13 Wallerand H,Robert G,Pasticier G,et al.The epithelial-mesenchymal transition-inducing factor TWIST is an attractive target in advanced and/or metastatic bladder and prostate cancers[J].Urol Oncol,2010,28(5):473-479.

14 Qiao B,Johnson NW,Gao J.Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factorbeta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and-9 expressions[J].Int J Oncol,2010,37(3):663-668.

15 Kojc N,Zidar N,Gale N,et al.Transcription factors Snail,Slug,Twist,and SIP1 in spindle cell carcinoma of the head and neck[J].Virchows Arch,2009,454(5):549-555.