子宮頸鱗狀細胞癌中SCCA1和SCCA2的表達及意義

閆麗雋， 趙 欣， 邵淑麗 (山西省腫瘤醫院婦科， 太原 030013;通訊作者，E-mail:YLJ7576@sina.com)

子宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一，在發展中國家尤為常見，是婦科三大惡性腫瘤之一，其死亡率占中國女性癌癥的第2位［1，2］。在子宮頸癌的組織學分型中鱗狀細胞癌(包括角化型43.3%，非角化型 29.1%，小細胞型 10.9%)就占83.3%。鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關抗原，其血清學檢測已被廣泛用于臨床子宮頸癌的輔助診斷，且具有器官特異性較高和良性疾患特異性較低的特點，但值得注意的是在體外收集標本和測量過程中存在影響因素，如皮膚污染和涎液可能強烈影響SCC-Ag的水平，在患一些良性疾病如肺結核、支氣管囊腫、皮膚濕疹、牛皮癬等時，SCC-Ag也可以升高。Buyru等［3］發現檢測癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規檢查的較低診斷率，我們用TaqMan探針real-time-PCR方法檢測子宮頸鱗狀細胞癌組織中SCCA1 mRNA和SCCA2 mRNA的表達并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選擇2006－01～2007－01山西省腫瘤醫院首診的子宮頸鱗癌患者60例，采用FIGO1985年臨床分期標準分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例(取門診首診患者活檢組織)，年齡27－66歲，平均年齡53.93歲。收集手術切除的子宮頸鱗癌新鮮癌組織標本，取30例因子宮肌瘤作全子宮切除的正常子宮頸組織作對照(均經病理證實)。

1.2 試劑 Trizol液，氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC水，M-MLV cDNA Kit(上海生物工程技術服務有限公司);瓊脂糖(AgaroseⅡ，加拿大 BBI公司)，擴增試劑盒TagMan universal master mix reactions(Applied Biosystems，Foster City，CA)美國 Taq-Man公司;基因表達試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)美國TaqMan公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 采用Trizol試劑提取子宮頸組織中總RNA，取1 μl經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3.2 cDNA合成 應用M-MLV反轉錄酶(上海生工)制備cDNA，以Oligo-p(dT)為引物，按說明書操作合成cDNA第一鏈。操作步驟:模板RNA 2 μl，Oligo-p(dT)引物 1 μl，RNase-free H2O，定容至12 μl，70 ℃ 5 s。再加入 5 × 反應液 4 μl，RNase 滅活酶 1 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl，37 ℃ 5 s。加M-MLV反轉錄酶1 μl 37℃ 60 s，70℃ 10 s終體積為 20 μl，結束反應，加 RNase-free H2O 至 200 μl，－80℃冷凍保存。

1.3.3 RT-PCR 在 ABI Prism 7000(ABI公司，美國)實時熒光定量PCR儀上進行實時定量擴增，總反應體系為 25 μl，含 TaqMan 總反應體系 12.5 μl，上游和下游引物各 1.25 μl，TaqMan Probe RNasefree H2O 6.25 μl，cDNA 5 μl。反應條件為:2 min 50℃，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 1 min，共50 個循環，所有測定為雙管重復，以GAPDH為內參照基因。引物設計見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 結果判定 在每次實驗中系統濃度稀釋被用來測定擴增效率。SCCA1和 SCCA2基因相對于GAPDH的相對表達計算如下:相對表達率用公式△Ct=Ct目的基因－ Ct內參照基因，表示其表達的相對拷貝數，△Ct值越低，實際拷貝數越高。

2 結果

2.1 SCCA1和SCCA2 mRNA在子宮頸癌的表達SCCA2 mRNA在子宮頸鱗癌組織與正常子宮頸組織中的表達差異有統計學意義(P＜0.001)。SCCA2 mRNA在宮頸癌組織中表達較正常子宮頸組織中△Ct值低，其實際含量則高。而SCCA1 mRNA在兩種組織中的表達差異無統計學意義(P＞0.05，見表1)。

在癌組織中SCCA2 mRNA的表達高于SCCA1 mRNA，經配對t檢驗分析，差異有統計學意義(t=－11.347，P ＜0.001)。

表2 SCCA1和SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中的表達Tab 2 Expression of SCCA1 and SCCA2 mRNA in tissues of cervical squamous cell carcinoma and normal cervix

2.2 子宮頸癌組織中SCCA mRNA表達與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關系 有淋巴結轉移的宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達較無淋巴轉移的癌組織高，差異有統計學意義(t=2.853，P＜0.01)，而SCCA1 mRNA的表達則無統計學差異。

不同年齡及不同病理分級中SCCA2 mRNA及SCCA1 mRNA的表達差異均無統計學意義。

經單因素方差分析，不同臨床分期的患者癌組織中SCCA2 mRNA的表達差異有統計學意義(F=8.313，P=0.002)，經 LSD 法兩兩比較，三組間兩兩比較差異均有統計學意義，然后進行Sperman秩相關分析，結果顯示 r= －0.616，P ＜0.001，說明隨著臨床分期的增高，SCCA2 mRNA的表達增高。而SCCA1 mRNA在不同臨床分期之間差異無統計學意義(F=2.734，P=0.083)。

表3 SCCA mRNA表達與年齡、淋巴轉移、病理分級、臨床分期的關系Tab 3 Correlation of expression of SCCA mRNA with age，lymph node metastases，histological grade and FIGO stages

3 討論

鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關抗原，血清學檢測已廣泛被用于臨床子宮頸鱗癌輔助診斷，鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一個成員，存在于子宮頸、子宮、頭頸等鱗狀上皮細胞的細胞質中，特別是在非角化大細胞中含量豐富。但單獨測定SCC-Ag不能作為子宮頸鱗癌的診斷依據。Bugru等［3］發現檢測癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規檢查的較低診斷率。SCCA就其生物學活性來說屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，目前產生SCCA的兩種形式的基因SCCA1和SCCA2已被鑒別，其定位在常染色體 18q21.3 中大約 500 kb 的區域［4，5］，SCCA1和SCCA2在核苷酸水平上有98%的同源性，在氨基酸水平上有92%的同源性［6］，兩種基因分別編碼SCCA的兩種形式，SCCA1編碼中性形成的蛋白，SCCA2編碼酸性形成的蛋白。Barnes等［7］研究發現，SCCA2在宮頸鱗癌中的表達明顯增高，他認為此基因是更重要的腫瘤標記物。

在組織中檢測mRNA水平的SCCA1和2是困難的，因為兩者在核苷酸水平上有高度的同源性，Takeda等［8］發現用 RT-PCR可以區別組織中 SCCA1和SCCA2 mRNA的表達，同時Zen等［9］測定口腔鱗癌患者外周血中的SCCA mRNA和表皮生長因子mRNA，使用一般RT-PCR只能在少數病例中測到，而使用TaqMan RT-PCR時大約50%病例中有表達。本研究采用TaqMan探針實時熒光定量法分析60例子宮頸鱗癌組織及30例正常子宮頸組織中SCCA1和SCCA2 mRNA的表達，結果表明，SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織表達明顯高于正常宮頸組織，而SCCA1 mRNA在兩組間差異無統計學意義(P＞0.05)，Murakami等［10］研究發現 SCCA2 mRNA 的拷貝數在惡性組織中比正常組織中高，而SCCA1則沒有明顯的不同。這與本試驗的研究結果相符。并且Murakami等還認為有效地定量SCCA2 mRNA在鱗癌患者診斷和治療過程中是非常有意義的。因為SCCA2調節細胞遷移和侵襲病毒感染相關抗原E鈣蛋白的表達，而E鈣黏蛋白是一個與子宮頸鱗癌浸潤轉移有關的預后因素［11］，因此他們認為SCCA2可能與癌的侵襲和轉移行為有關。Nawata等［12］認為過度表達的SCCA2基因可能在腫瘤細胞的共性行為中扮演重要角色。

SCCA2 mRNA的表達與淋巴轉移的關系:腫瘤的浸潤和轉移是惡性腫瘤發展的兩個關鍵步驟，也是影響預后的重要因素，腫瘤的轉移是個高選擇、多步驟、多因素參與腫瘤細胞和宿主細胞相互作用的連續過程。子宮頸癌以直接侵犯鄰近組織和淋巴結轉移為主，血行轉移極少，影響子宮頸癌預后的臨床病理因素很多，其中淋巴結轉移是顯著的獨立預后因素。文獻報道，無淋巴結轉移患者5年生存率為82.2%，有淋巴結轉移者 5年生存率則為50.8%［13］。本實驗研究發現有淋巴結轉移組 SCCA2 mRNA的表達較無淋巴結轉移組高(t=2.853，P＜0.01)，SCCA1 mRNA表達則無此特點。由于腫瘤的浸潤和轉移都需要細胞外基質和基底膜的降解，推斷SCCA2能夠改變鱗癌細胞的侵襲表型，可能是通過刺激MMP-9蛋白的產生，而明膠酶MMP-9能分解基質膜中的巢蛋白，在腫瘤的侵襲轉移中起重要作用。另外，試管內侵襲分析發現SCCA1和SCCA2能顯著助長細胞的侵襲能力。本實驗僅發現SCCA2有此特點，因此還需大樣本實驗進一步證實。

SCCA2 mRNA的表達與臨床分期的關系:近年來臨床上提出了“腫瘤分子分期”的觀點，即將分子生物學的理論和技術與腫瘤的臨床分期有機地結合起來，來診斷那些常規檢查方法不能診斷的存在于全身各系統中的亞臨床轉移，使腫瘤的分期更加準確，以指導臨床治療方案的確定。本實驗結果顯示隨臨床分期的增高，子宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達有增高趨勢(r= －0.616，P ＜0.001)，SCCA2 mRNA的檢測有助于準確分期，從而更加有針對性制定個性化的治療方案，為改善預后提供可能。

SCCA1和SCCA2 mRNA在鱗狀上皮層呈特異性地表達，應用TaqMan探針real-time-PCR方法可以定量檢測mRNA的水平，能夠較直觀反映宮頸癌組織中SCCA的表達水平，為SCCA在宮頸癌的早期診斷、臨床分期及預后提供一定的理論依據，但關于SCCA1和SCCA2在腫瘤的發生發展過程中的各自及相互作用機制還需要深入研究。

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